ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה
7 בינואר 2019
פרוטוקול זה מתמקד ניתוח כמותי של מורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה, אשר יכול לשמש עבור מחקרים של מורפוגנזה דנדריטים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ההשפעה של הגן SOX5 על המורכבות של נוירונים arborization דנדריטי במהלך ההתפתחות העצבית ב Drosophila. שיטה זו יכולה לעזור ללמוד מורפוגנזה של נוירו-דנדריטים, ואת תפקוד הגנים בהתפתחות מערכת העצבים, כדי להבין טוב יותר גנים של מחלות נוירודגנרטיביות. בסופו של דבר טכניקה זו מספקת ניתוח כמותי של מורכבות דנדריטים, אשר ניתן להשתמש בהם בסוגים רבים ושונים של נוירו-דנדריטים.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון מנגנון גנטי של מחלה נוירו-ניוונית, משום שהמוטציה מחזיקה במפתח להבנת תפקוד הגנים. צלבים מוגדרים של UAS-GFP;ppk-GAL4 עם זבובי זן UAS-Sox102F-RNAi או פקדי W118. תרבות הזבובים בתנאים סטנדרטיים ב 25 מעלות צלזיוס.
בעוד חמישה עד שישה ימים, השתמש במטסים כדי לאסוף בזהירות את הזחלים השלישיים של instar לצורך ניתוח. מניחים זחל בצלחת ניתוח עשוי בסיס אלסטומר סיליקון, וצלחת פטרי רקמות תרבות. לאחר מכן מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ הניתוח.
עכשיו תצמיד את זנב הזחל כדי לחשוף את קו האמצע. ואז להצמיד את הזחלים הפה ווים כך הצד הגבי של הזחל הוא למעלה. עכשיו להוסיף 200 microliters של PBS לצלחת כדי לטבול את הזחל בתסרון.
לאחר מכן, חותכים את הזנב והפה של הזחל עם חתכים קטנים. ואז לחתוך את הזחל פתוח לאורך קו האמצע הגבי ובין שתי קנה, הולך מן caudal כדי rostral. ואז למקם סיכה בכל אחת מארבע הפינות של הגוף כך הגוף שוכב שטוח.
עכשיו לתקן את קיר גוף הזחל בארבעה אחוזים PFA במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את הזחל עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה, להסיר את הפינים ולהעביר את הרקמה על מגלשת זכוכית.
ואז לטבול את הרקמה במדיום הרכבה antifade, ולהוות אותו עם להחליק כיסוי. אפשר לרקמה המותקנת להתייבש במשך שעה לפני האיטום על החלקת המכסה עם לק ציפורניים. אחסן את השקופיות האלה בחושך בארבע מעלות צלזיוס.
לכוד תמונות מסדרת z באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל באמצעות מטרה של פי 20. ראשית, להגדיר את הטווח של z-צעדים לכלול את כל הנוירונים DA בקיר גוף הזחל, ולהגדיר את גודל הצעד לחצי מיקרומטר. לאחר מכן אחסן את התמונות כקבצי TIF או ND2 לעיבוד.
לאחר מכן, להעריך את המספר והמורפולוגיה של הדנדריטים על הנוירונים DA. התחל בהערכת אורכיהם. ראשית, בפיג'י ImageJ, לפצל את התמונות לערוצים נפרדים במידת הצורך.
יש להעריך רק את ערוץ GFP. לאחר מכן, לעשות z-הקרנה. בחלון החדש, בחרו בעוצמה מרבית לסוג ההקרנה ובחרו בפרוסות ההתחלה והעצור.
לאחר מכן לחצו על הלחצן 'אשר' להפקת תמונת z-projection עם הקרנות דנדריט ברורות. עכשיו תאתר את הניריטים באמצעות כלי התוסף. ראשית, ללכת לסומה של הנוירון של עניין ולחץ שבו דנדריט אחד יוצא מגוף התא.
לאחר מכן לחץ בקצה של דנדריט זה. אם הקו הכחול המחבר בין שתי הנקודות פועל לאורך הנויריט, הקש Y עבור כן. לאחר מכן, אם קו זה מתאים לנתיב המלא של הנויריט, לחץ על נתיב שלם.
אם הקו אינו מתאים לנתיב, לחץ על נקודות בהמשך נויריט זה כדי לכופף את הנתיב למקטעי קו מרובים שיתאימו לאורך הנויריט. לאחר מכן, לחץ על נתיב שלם והמשך בסימון הנתיב עבור הנויריט הבא. לאחר השלמת כל נתיבי העקיבה, בחרו באפשרות 'ניתוח', 'מדוד נתיבים' לייצוא הנתיבים לקובץ CSV.
השתמש בנתונים אלה כדי לחשב ערך ממוצע של אורכי נתיב לניתוח. לאחר מכן, לחשב את שטח הפנים של הנוירון. ראשית, בחר את כלי ציור היד החופשית מחלון פיג'י ImageJ.
לאחר מכן, לחבר את נקודות הקצה של הנוירון של עניין. לאחר מכן, בחרו באפשרות 'מדידה' מהחלון 'נתח'. התוצאה מופיעה בתיבה חדשה עם הערך עבור האזור שנבחר.
העתק ערך זה לתוכנה לניתוח נתונים. לבסוף, לחשב את המספר הכולל של ענפים באמצעות תוסף ניתוח נתיבים שלדים. הדנדריטים של נוירונים DA תויגו על ידי שיתוף overexpressing GFP שלהם סומא דנדריט ארבורים לניתוח הדמיה פלורסנס GFP.
המורפולוגיה של דנדריטים תצולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל הפוך. הדנדריטים של תאי העצב של התובע המחוזי אותרו כמתואר. הקובץ שימש להערכת אורך הנדריט.
השתק של Sox102F בנוירונים DA בזחל instar השלישי הוביל לירידה משמעותית במספר הכולל של דנדריטים עם כמחצית אורך הענף עם מבנה פשוט יותר, מראה רק מחצית ממספר הענפים. מבחינה הגיונית, זה הוביל לירידה בשטח הפנים של הארבור. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה להערכת התפתחות של נוירונים חושיים DA.
בעת ניסיון הליך זה, הקפד לקחת מספר רב של תמונות של כל קבוצה של נוירונים DA כדי לקבל כיסוי טוב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח דנדריט על מנת לענות על שאלות נוספות על התפתחות דנדריט. מאז התפתחותה, טכניקה זו סייעה לחוקרים בתחום מדעי המוח להסיק מסקנות למחלות ניווניות כגון אלצהיימר באמצעות מערכות מודל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לניתוח כמותי של מורכבות הענפיות הדנדריטית העצבית (NDAC) בזבוב הדרוסופילה (Drosophila), תוך התמקדות בהשפעת הגן SOX5 במהלך ההתפתחות העצבית. באמצעות בחינת המורפוגנזה הדנדריטית, טכניקה זו שואפת להעמיק את ההבנה של מנגנוני מחלות נוירודגנרטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- התפתחות נוירונלית
- גנטיקה
רקע
- הבנת המורכבות של הסתעפות דנדריטית היא קריטית במחקרי התפתחות עצבית.
- הגן SOX5 ממלא תפקיד משמעותי בהתפתחות נוירונלית.
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודל חשוב לחקר תפקודים גנטיים במערכת העצבים.
- תובנות לגבי מורפוגנזה של דנדריטים עשויות להוביל להתקדמות במחקר על מחלות נוירודגנרטיביות.
מטרת המחקר
- להערכת השינויים המורפולוגיים בענפות הדנדריטים כתוצאה ממניפולציה של הגן SOX5.
- לאפשר השוואה כמותית של מורכבות דנדריטית בין רקעים גנטיים שונים.
- לספק מסגרת למחקר של התפתחות נוירונלית ומחלות נוירוגניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש בפסילת Drosophila בשלב השלישי של הזחילה לצורך דיסקציה והדמיה.
- הוצבה מיקרוסקופיה קונפוקלית להדמיה מפורטת של מבנים דנדריטיים.
- התהליך כלל קיבוע של רקמות והדמיית פלואורסצנציה של GFP לצורך אנליזה.
- שלבים מפורטים לדיסקציה של הזחילה ועיבוד המשך לצורך ויזואליזציה של מורכבות הדנדריטים.
- ניתוח הנתונים כלל מעקב אחר דנדריטים וחישוב אורכים, שטח פנים ומורכבות הסתעפויות.
תוצאות עיקריות
- השתקה של SOX5 הובילה להפחתות משמעותיות במספר ובאורך הדנדריטים.
- שינויים בולטים במבנה הדנדריטי, המעידים על תפקידו הקריטי של הגן בהתפתחות דנדריטית.
- סופקה שיטה להערכה כמותית של שינויים מורפולוגיים בנוירוני DA.
- הממצאים מדגישים את הקשר בין מניפולציה גנטית לבין מורכבות דנדריטית.
מסקנות
- פרוטוקול זה מסייע להבנה מעמיקה יותר של התפתחות דנדריטים והשלכותיה על מחלות נוירודגנרטיביות.
- שם דגש על חשיבותו של הגן SOX5 בארכיטקטורה הנוירונלית.
- מקדם אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות באמצעות הבהרה של מנגנוני מורפוגנזה של דנדריטים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
ניתוח כמותי של מורכבות הסתעפות דנדריטית ב-Drosophila מספק מסגרת חסונה לבדיקת תפקוד גנים ומורפוגנזה נוירונלית בשלבי הגילוי המוקדמים במדעי המוח. זרימת עבודה זו מאפשרת ביטחון חיזוי בקישור בין הפרעות גנטיות, כגון השתקה של SOX5, לשינויים מדידים במבנה הנוירונלי, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלב תיקוף המטרה. גישה זו רלוונטית ישירות להחלטות לגבי תיקי פיתוח במסלולי מחקר של מחלות נוירו-התפתחותיות ומחלות ניווניות של מערכת העצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות גנטיות בהתפתחות העצבית באמצעות נקודות קצה מורפולוגיות כמותיות.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגונונית על ידי קישור מניפולציה גנטית לשינויים בפנוטיפ נוירונלי.
- מסייע במיון של מטרות מועמדות על בסיס השפעה מדידה על המורכבות הדנדריטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מגדיר תהליכי עבודה סטנדרטיים של דימוי ואנליזה לצורך כימות הדיר עקבי של מורפולוגיה נוירונלית.
- מייצר פלטים כמותיים—אורך דנדריטים, שטח פנים ומספר ענפים—המתאימים לסריקות המשך.
- מכין מערכות ביולוגיות מתוקשפות להערכה של תרכובות או משנים גנטיים בפורמטים ניתנים להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים פנוטיפים מורפולוגיים לתפקוד עצבי לקוי הרלוונטי למחלה לצורך חקירת ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רצף מהגילוי הגנטי ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים במחקר של ניוון עצבי.
- מאפשר קידום מותאם-סיכון של מטרות עם השפעה מוכחת על המבנה העצבי.
שילוב תהליכי עבודה וצנחורי עיבוד
סבב עבודה כמותי זה משלב שלבים החל מגילוי מוקדם ועד לזיהוי מוביל (lead identification), ותומך בבדיקת היפותזות ובתיקוף מנגוני במסלולי עבודה בביולוגיה של מערכת העצבים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בחקירה מונחית-השערה של תפקוד גנים במורפוגנזה נוירונלית.
- סריקה: מספקת תוצאות מורפולוגיות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך ניתוח השוואתי.
- אנליטיקה: מספקת פלטי סטטיסטיים — אורך, שטח ומספר ענפים — להשוואה איתנה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הפרעה גנטית לבין פנוטיפים נוירונליים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה רב-פעמית לדימוי וניתוח עבור מחקרים נוירו-גנטיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה ומפחית עמימות מנגנונית בנוירוגנטיקה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הדימות והניתוח לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי התמקדות בפנוטיפים עצביים מתוקפים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מטרות התפתחותיות עצביות וניוורודגנרטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות קונפוקאלי, דיסקציה נוירונלית וניתוח תמונה כמותי.
- תלוי בגישה לתשתית מיקרוסקופיה מתקדמת ותשתיות לניתוח חישובי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדימות ועיבוד הנתונים.
- ניתן להתאמה לרקעים גנטיים אחרים או לסוגי נוירונים אחרים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות מעשיות כוללות את קצב הדימות (throughput) ושונות פוטנציאלית בהכנת הדגימות.
