ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

שיטה זו יכולה לעזור בשאלת מפתח בתחום הנדסת תאי גזע כגון, כיצד מיקרו-סביבה תאית משנה את הפנוטיפים והתפקוד של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת את הסביבה המרובה שנוצרה באופן מלאכותי לתאים בצלחת אחת, מה שלא ניתן לבצע בשיטה קונבנציונלית בצלחת מיקרו-מגע, מה שמדגים את ההליך הזה יהיו טכנאי קוקי יושימוטו וריסקו סאקאי מהמעבדה שלנו. לאחר יצירת תמונות תלת מימד של מסכות למערכי ננו סיבים ותבניות ממבנים מיקרופלואידיים על פי פרוטוקול הטקסט.

השתמש במדפסת תלת מימד כדי להדפיס את המסכות והתבנית. להכנת תמיסות פולימריות לספינינג אלקטרו, יש לדלל 13 אחוז נוזל PMGI עם טטרהידרופוראן לתשעה אחוזים. ממיסים 0.08 גרם PS ביחס נפח אחד לאחד של THF לדימתילפורממיד והשתמשו בריג'נט נוזלי כדי להעלות את הנפח למיליליטר הסופי של שמונה אחוז משקל לכל תמיסת PS לנפח.

ממיסים 0.1 גרם GT במים, חומצה חומצית ואתיל אצטט והשתמשו בתמיסת הממס המעורבת כדי להעלות את הנפח למיליליטר הסופי של 10 אחוז משקל לפי נפח תמיסת GT. לאחר מכן, באמצעות מכונת התזת מגנטרון, הניחו שכבת פלטינה בעובי חמישה ננומטר על לוחית בסיס פוליסטירן המשמשת כקתודה במערך הסיבוב החשמלי. טען כל תמיסת פולימר למזרק של חמישה מיליליטר המצויד במחט קהה מנירוסטה בגודל 23

ואז עוגן את המזרקים על משאבת מזרק במרחק של 12 סנטימטרים מהאספן של מכשיר הספינינג האלקטרו. חבר את מחט המזרק למתח גבוה והגדר אותה ל-11 קילו-וולט. לאחר מכן הגדר את קצב השאיבה ל -20 מיליליטר לשעה ושמור על הטמפרטורה והלחות על 30 מעלות צלזיוס ופחות מ -30 אחוז בנפח, בהתאמה.

כעת הניחו את המסכה על צלחת הבסיס. לאחר מכן, דרך חורי המסכה, יצרו סיבי ננו על לוחית הבסיס בצפיפות ברורה על ידי שינוי זמן הסיבוב החשמלי. הסר את המסכה מלוח הבסיס וחזור על ייצור סיבי הננו.

לאחר השלמת המערך, הנח אותו בחומר ייבוש בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות כדי לאדות את הממס שנותר. כדי להצליב את סיבי הננו GT, טפל בהם עם 0.2 EDC מולרי ו-0.2 NHS מולארי באתנול. ולדגור את הדגימות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

כדי לשטוף את סיבי הננו GT, השתמש פעמיים באתנול 99.5 אחוז וייבש את הצלחות בוואקום ב-25 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. כדי לייצר מבנים מיקרופלואידיים, מערבבים 2 גרם חומר ריפוי PDMS ו-20 גרם בסיס PDMS. לאחר מכן יוצקים את תערובת ה-PDMS על התבנית המפוברקת.

בחומר ייבוש יש להוציא את התערובת שלפני ה-PDMS למשך 30 דקות. לאחר מכן מרפאים את תערובת ה-PDMS המוקדמת בתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. כדי להרכיב מערכי Macme, קלף את מבנה ה-PDMS הנרפא מהתבנית והשתמש ב-70 אחוז אתנול כדי לנקות אותו.

ואז לפרוק עטרה אטמוספרית בצד התחתון של מבנה ה-PDMS. הרכיבו במהירות את מבנה ה-PDMS עם מערך סיבי הננו. לאחר מכן אופים את המכלול בתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך יומיים.

באמצעות DPBS שטפו H9HESCs מתורבתים על צלחת 35 מילימטר. לאחר מכן מוסיפים למנה 0.5 מיליליטר פרוטאז קל טריפסין רקומביננטי ודוגרים אותו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה. שאפו בזהירות על תערובת הפרוטאז הסופרנטנטית.

הוסף מיד מדיום HPSC והוציא בעדינות את המדיום על פני הכלי שוב ושוב כדי לנתק תאים. לאחר מכן העבירו את התאים המנותקים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של הצינור כוח משיכה פי 200 למשך שלוש דקות.

שאפו את הסופרנטנט והשעו את התאים במדיום HPSC שחומם מראש. לאחר מכן פיפטה 12 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל תא מיקרופלואידי. לאחר תיוג פלואורסצנטי של התאים בהתאם לפרוטוקול הטקסט, קלף את המבנה המיקרופלואידי PDMS ממערך ה-Macme.

לאחר מכן הסר את שאריות ה-PBMS ממערך ה-Macme, הוסף 90 אחוז גליצרול ב-PBS לתאים המוכתמים והחל פתק כיסוי. לבסוף, הניחו את הצלחת הפוכה על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. והשתמש בתוכנת הדמיית המיקרוסקופ כדי לרכוש תמונות צבעוניות של 12 סיביות.

מוצגות כאן תמונות אימונופלואורסצנטיות של H9HPSCs שגודלו בצפיפות זריעה ראשונית גבוהה על סיבי ננו ג'לטין וצבועים ב-3 סמנים פנוטיפיים תאיים. ניתוח SOM שימש להמרת מערכי נתונים רב-פרמטריים רב-ממדיים למפות דו-ממדיות נמוכות להשוואת הומוגניות והטרוגניות של רמות הביטוי עבור ארבעת הסמנים הפנוטיפיים בכל מערך נתונים ובוצע אשכולות היררכיים ללא פיקוח עבור צמתי ה-SOM. כפי שצוין כאן, כל הקבוצות הראו ביטוי גבוה יותר של OCT4 מאשר נצפה במטריצת ג'ל ממברנת הבסיס, או MG. קבוצה ראשונה הראתה אותות EdU גבוהים, מה שמצביע על כך שרוב התאים מתרבים באופן פעיל.

לפיכך, מיקרו-סביבות בקבוצה הראשונה התאימו לתחזוקת HPSC מכיוון ש-HPSCs לא מובחנים מתרבים במהירות כאשר שלבי הפער במחזור התא קוצרו. קבוצה שנייה כללה תאים שנזרעו בצפיפות התחלתית לא מספקת ותאים שגודלו על פיגומי GT דו-ממדיים שלא תמכו בחידוש עצמי של HPSC. לדוגמה, אות ה-EdU של דגימה זו אבד ורמות הנספח V עלו מעט, מה שמצביע על כך שהתאים איבדו את הגזע שלהם והפכו בהדרגה לאפופטוטיים.

PMGI MidNF HighCD מקבוצה שלוש המייצגת את המיקרו-סביבות המרכיבות מטריצות ננו סיבים PMGI הראו את השינויים הגדולים יותר באותות OCT4 ו-EdU בהשוואה לתנאים האחרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר בתחום תאי הגזע לחקור את הנדסת הרקמות והסינון המתקדם.