אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על מערכת העצבים המעי, כגון פרופיל הביטוי של גרעיני המעי במעיים של בני אדם בוגרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי להשיג תשואות גבוהות של RNA מגרעיני מעיים אנושיים תוך שמירה מקסימלית על איכות ה-RNA. התחל עם רקמת מעי חתוכה באורך של 20 סנטימטר.

ראשית, חתוך את רקמת השומן והחיבור. הימנע מחתך הסרוזה, מה שעלול להוביל לנזק מבני למקלעת המיאנטרית. לאחר מכן, בצע חתך אורכי לכל אורך הדגימה הגזומה, רצוי באתר ההתקשרות המזנטרי.

לאחר מכן, נתחו והשליכו את ה-taeniae coli מהמעי הגס כדי שהרקמה תוכל להשתטח. כעת, מרחו את המעי, כשהרירית כלפי מטה, על קרש חיתוך צונן. לאחר מכן, חותכים רצועות ברוחב 1.25 סנטימטר לכל אורך הרקמה.

כשהם נחתכים, העבירו כל חתיכה לתמיסת אחסון רקמות צוננות לאחסון זמני. לאחר מכן, חותכים כל רצועה למקטעים שאורכם שניים עד 1.5 סנטימטרים. לאחר חיתוך רצועה למקטעים, יש למחוק את הקטעים יבשים.

חשוב שהרקמה תהיה יבשה מאוד כדי שלא ייווצרו גבישי קרח על הרקמה כשהיא קפואה. כעת, סדרו את חתיכות הרקמה המיובשות, כשהרירית כלפי מעלה, על תבנית פלסטיק קרה וחד פעמית. לאחר מכן, שטחו כל חתיכה באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי להסיר בועות אוויר כלואות.

הרקמות יתרחבו ככל שהן שטוחות. לאחר שיטוח מקטעי הרקמה, העריכו את עוביהם לפני ההקפאה. במידת הצורך, דחוף את שולי הדגימה פנימה עד שדגימת המעי מתקרבת לעובי המקורי שלה.

כעת, העבירו את תבנית הבסיס העמוסה על תרחיץ של קרח יבש ו-2-מתילבוטן. הרקמה אמורה לקפוא לחלוטין תוך 30 עד 60 שניות. לאחר מכן, יבש מיד את תחתית התבנית בעזרת מגבונים קרים שנשמרו על קרח יבש.

כעת, בדוק את המדגם. שימו לב לכל הדגימות שאינן נראות שטוחות. לאחר מכן, עטפו את התבנית בנייר אלומיניום שסומן מראש וצונן לפני השימוש.

לאחר מכן, כסו את נייר הכסף בשכבת ניילון נצמד כדי למזער התייבשות. שמור את הדגימות על קרח עד שניתן יהיה לאחסן אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הכנת החומרים הנדרשים, שפכו תלולית של שלושה עד חמישה מילימטרים של TFM על מחזיק דגימת קריוסטט גדול והעבירו מיד את דגימת המעי, עם צד הסרוזה כלפי מעלה, אל ה-TFM.

לאחר מספר שניות בטמפרטורת החדר, העבירו את מחזיק הדגימה לקרח יבש וכסו אותו באבקת קרח יבש. לפני החיתוך, וודא שה- TFM נמצא מתחת למישור המקלעת המיאנטרית. לאחר מכן, הרכיב את מחזיק הדגימה לתוך ראש דגימת הקריוסטט ויישר את הדגימה עם להב הקריוסטט.

הפוך את מישור המקלעת המיאנטרית למקביל ללהב החיתוך. כעת, צרו שמונה קטעי מיקרון דרך הסרוזה ושריר האורך עד שתגיעו למקלעת המיאנטרית כדי לאתר את מקלעת המיאנטרית, הרכיב דגימה וצבוע אותה בצבע מימי, כגון 1% סגול קריסטל.

כדי להמשיך, זהה את הצומת בין שכבות השרירים האורכיות והמעגליות. בתחילת החיתוך, הסרוזה תסומן בנוכחות רקמת חיבור. חלק מהשומן המזנטרי שנותר עשוי להיות נוכח גם לאורך הסרוזה.

לאחר מכן, היריעה של שכבת השריר האורכית החיצונית נראית לעין לאחר שהושג הגבול בין שכבות השרירים האורכיות והעגולות, ייצפה חלק מגרעיני המעי. בחלקים הבאים, מקלעת המיאנטרית תהיה ברורה מאוד עם רצועות גדולות של גנגליונים בתוך קטע אחד. כעת, אסוף קטעים סדרתיים עבור המיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר.

צ'יל PEN מחליק בקריוסטט למשך חמש עד 10 שניות והשתמש בהם כדי להרכיב את החלקים. בקטעים הטובים ביותר יהיו הרבה נוירונים וגליה. כעת, המשך להכתים ולאחר מכן לייבש את החלקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

בהכנה, הכנס מחסנית של כובעי LCM לשלב המיקרוסקופ LCM. לאחר מכן, טען את השקופית לדוגמה על הבמה ורכוש תמונת סקירה כללית של השקופית. זהה את המיקום הרצוי עבור LCM וטען מכסה על המגלשה.

לאחר מכן, יישר את לייזר האינפרא אדום והתאם את עוצמת הלייזר ומשך הזמן לנקודת לכידה בקוטר 20 עד 30 מיקרון. לאחר מכן, תאר את הגרעינים הרצויים לאיסוף. הקפידו להישאר בגבולות אזור האספנות על הכובע, המוצג כעיגול ירוק.

עבור כל אחד מהגנגליונים המתוארים על ידי עקבות חיתוך UV, התאם את כתמי ה-IR כך שתהיה לפחות נקודת IR אחת כל 100 עד 500 מיקרון כדי להבטיח שכל הגרעינים ייאספו כאשר המכסה מורם מהדגימה. לאחר מכן, לחץ על כפתור IR UV Cut כדי להמשיך באיסוף כל הגרעינים המסומנים. לאחר השלמת האיסוף, העבר את המכסה למיקום חדש וחזור על תהליך האיסוף.

ניתן לחזור על זה במשך 60 עד 80 דקות. כאשר מכסה ה- LCM עמוס במספיק גנגליונים, העבר אותו לתחנת בקרת איכות. אם יש פסולת על המכסה, נגב אותה באמצעות מברשת צבע עדינה שהוכנה לשימוש ב-RNA.

השתמש בקצה פיפטה לכל פסולת שקשה להסיר. לאחר מכן, אבטח את המכסה על צינור מיקרופוגה של 0.5 מיליליטר מלא ב-230 מיקרוליטר של מאגר ליזה RNA. הפוך את המכסה, מערבל אותו לזמן קצר ולאחר מכן דגר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

מאוחר יותר, צנטריפוגה את הדגימה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 5,000 גרם ומעלה, ולאחר מכן העבירו את צינור המיקרופוגה לקרח יבש. הדגימה מוכנה כעת למיצוי ה-RNA. בעת משיכת שני כובעים של גנגליונים אנטרי לדגימה, התקבל יותר מננוגרם אחד של RNA, מספיק ל-RNA-Seq, וה-RNA היה באיכות מעולה.

שלמות ה-RNA של הדגימה המוצגת היא 8.3. כמו כן נאספו דגימות עם מספרי תקינות של 7.5 ו-6.9. בסך הכל, יותר מ-95% מכלל הדגימות המוכנות היו טובות מספיק עבור RNA-Seq.

איכות מערכי הנתונים של RNA-Seq הוערכה באמצעות צינור ביואינפורמטיקה. הטיית הקצה מצביעה על כך שהדגימות רוצפו בהצלחה והיו להן הטיה צנועה של שלושה קצה ראשוני. תרשים ביוטיפ של גנים מראה שתוצאות הריצוף היו עקביות במידה רבה.

לאחר השליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לאסוף שכפולים ביולוגיים של RNA מגרעינים אנטריים באיכות ובכמות מספיקים עבור RNA-Seq תוך שמונה עד 12 שעות בלבד. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שדגימות המעי האנושיות יוקפאו שטוחות ככל האפשר. זה יבטיח שתוכל לאסוף חתכים גדולים מאוד של גרעיני מעיים אנושיים המעובדים במהירות ובקלות באמצעות מיקרו-דיסקציה לכידת לייזר.