קיבעון ריאה תחת לחץ מתמיד על הערכה של אמפיזמה בעכברים
26 בספטמבר 2019
מוצג כאן הוא פרוטוקול שימושי עבור קיבעון ריאה שיוצר מצב יציב עבור הערכה היסטולוגית של דגימות ריאה ממודל העכבר של אמפיזמה. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהוא יכול לתקן את הריאות הרבה עם הלחץ התמידי אותו ללא התמוטטות ריאה או בדלציה.
הלחץ המתמיד בתוך מכשיר קיבוע שומר על הריאות במצב מנופח למדי יצירת דגימת ריאות היסטולוגית המתאימה להערכת אמפיזמה עשן סיגריות קלה המושרה. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שזה יכול לתקן ריאות רבות באותו זמן באמצעות אותו לחץ מתמיד ללא קריסת ריאות או דפלציה. הדגמת ההליך תהיה נאוקו ארנו סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
לאחר אישור חוסר תגובה לתנועה רפלקס לעשות חתך בעור ברקמת השריר לאורך הקו המדיאלי של העכבר, מכוון לאזור cephalic, לחתוך באופן מאוחר יותר כדי ליצור מרחב עבודה רחב יותר. לאחר חשיפת שכבת הסרעפת לנקב את הרקמה עם מלקחיים ולפתוח את שטח בית החזה. חותכים את אזור החזה ומאפשר לריאות וללב להיות חזותיים.
וחותכים את האולם השמאלי ואת החדר הימני. הכנס 24 מד cannula מחובר משאבת זלוף לתוך אזור החדר הימני ולכוון את cannula לאזור cephalic עד שהוא מגיע לעורק הריאה. לאחר מכן, להפעיל את המשאבה ולבלבל את הרקמה עם כ 200 מיליליטר של PBS במשך שעה אחת עד שכל רקמת הריאה השתנתה לצבע לבן.
בסוף התדלוק חתכו את רקמת החיבור המקיפה את קנה הנשימה, הריאות והלב, ולהשתמש בתפר כדי לקשור את הסונפנוס הראשי הנכון. לאחר מכן, לקצור את כל האונות הבודדות של הריאה הימנית ולמקם את הלב ואת האונות של הריאה השמאלית לתוך מזרקים בודדים 10 מיליליטר המכיל תיקון מתאים. נסיגה הבוכנה יצירת ואקום במזרק כדי לנפח את הריאות ולהסיר את הריאה מהמזרק.
הכנס 20 מד cannula לתוך קנה הנשימה ולהשתמש בתפר כדי לאבטח את cannula במקום. חבר מזרק מיליליטר אחד מלא fixative ל cannula ולמלא את הריאה עם תיקון נוסף כדי לבדוק דליפות. ודא כי אתר הכניסה היה מאובטח כדי למנוע את דגימת הריאה להתנתק לוח הריאה במהלך הקיבעון.
לאחר מכן להעביר את הרקמה לציוד לחץ קיבוע הריאות, הסרת המדגם וקשירת קנה הנשימה עם קשר בסוף תקופת הקיבוע. המרכיב התחתון של ציוד לחץ קיבוע הריאות שלתוכם מוכנסת דגימת הריאה מחובר באמצעות 20 אומד cannula לקצה זרימת הפורמלין עם stopcock שלוש דרך. לחץ נוצר מרמות פני השטח השונות של התיקון בין התאים התחתונים העליונים.
הפרש הלחץ הוא 25 ס"מ של מים אבל כפתור התאמת הגובה יכול לשמש כדי להתאים את הלחץ בין 25 ל 30 ס"מ של מים. משאבה מחברת את המכולות התחתונות והתחתונות, תוך שמירה על הפרש של 25 ס"מ בגובה פני השטח המקבע, ומכוונת את זרימת הסוכן. לאחר 48 שעות של קיבעון הריאות מעכברי נוקאאוט SMP30 החשופים לאוויר הסביבה אינן מפגינות הגדלה ניכרת של המרחב האווירי.
הגדלת מרחב אווירי משמעותית והרס קיר מכתשי, לעומת זאת, נצפו בעכברי נוקאאוט SMP30 חשופים לעשן סיגריות כרוני. בנוסף, היירוט ליניארי הממוצע והאינדקס ההרסני של דגימות הריאה גדולים משמעותית בעכברי הנוקאאוט SMP30 החשופים לעשן מאשר באוויר שנחשף לבעלי חיים. המעבדה שלנו משתמשת 10% פורמלין אבל החוקרים יכולים להשתמש סוכני קיבעון אחרים על פי הצרכים הניסיוניים שלהם.
כפי שדיווחנו באמצעות דגימות ריאות מערכת קיבעון הפגינו ניתן לקצור מודלים שונים של אמפיזמה העכבר להערכה מורפומטרית שלהם. כמו סוכני תיקון יכול להיות מסוכן תמיד ללבוש את ציוד מגן כוח אדם המתאים ולעבוד בחדר מאוורר היטב.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לקיבוע ריאות המבטיחה תנאים יציבים להערכה היסטולוגית של דגימות ריאה ממודל עכברים של אמפיזמה. הטכניקה מאפשרת קיבוע של מספר ריאות בו-זמנית ללא קריסה או התרוקנות מהאוויר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- היסטולוגיה
רקע
- נפחת היא מחלה ריאתית המושרית לעיתים קרובות על ידי עישון סיגריות.
- הערכה היסטולוגית היא קריטית להבנת הפתולוגיה של הריאה.
- שמירה על ניפוח הריאה במהלך הקיבוע חיונית לצורך הערכה מדויקת.
- פרוטוקול זה נותן מענה לאתגרים בטכניקות קיבוע של ריאות.
מטרת המחקר
- להצגת שיטה מהימנה לקיבוע ריאות.
- להקלה על הערכת דגימות ריאה במחקר.
- לשיפור העקביות בניתוח היסטולוגי של מודלים לאמפיזמה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש במכשיר קיבוע השומר על לחץ קבוע.
- ביצוע חתך לאורך הקו המדיאלי של העכבר כדי לגשת לחלל בית החזה.
- ניקור הסרעפת לפתיחת חלל בית החזה.
- ויזואליזציה של הריאות והלב לצורך איסוף דגימות.
תוצאות עיקריות
- שמירה מוצלחת על ניפוח הריאות במהלך הקיבוע.
- יכולת קיבוע של מספר ריאות בו-זמנית.
- דגימות היסטולוגיות יציבות המתאימות להערכה.
- הדגמה של הפרוצדורה על ידי סטודנט לתואר מתקדם.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לקיבוע ריאות.
- הוא משפר את איכות ההערכות ההיסטולוגיות במחקר.
- ניתן ליישם טכניקה זו במגוון מחקרים העוסקים בפתולוגיה של הריאות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
קיבוע עקבי של הריאות תחת לחץ קבוע נותן מענה לאתגר קריטי במודלים פרה-קליניים של מחלות נשימה, על ידי מתן אפשרות להערכה היסטולוגית הדירה של נפיחות ריאתית (emphysema) בעכברים. שיטה זו תומכת בניתוח מורפומטרי מהימן, מפחיתה שונות ומגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של מחקר על COPD. היכולת לעבד מספר דגימות בו-זמנית מייעלת מחקרים השוואתיים ותומכת בהחלטות תזונה (triage) חסונות של פורטפוליו המחקר.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה מורפומטרית סטנדרטית של חומרת האמפיזמה במודלים של עכברים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות פוטנציאליות על ידי אספקת ארכיטקטורת רקמה הניתנת לשחזור.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מזעור ארטיפקטים הנגרמים מקביעה.
- משפר את הביטחון החיזוי במתן קישור בין נקודות קצה היסטולוגיות להיפותזות מכניסטיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין דגימות ריאה שעברו תיקוף עבור בדיקות היסטולוגיות כמותיות בהמשך התהליך.
- מבטיח הדירות ויכולת השוואה בין קבוצות ניסוי שונות.
- תומך בעיבוד ניתן להרחבה של מספר דגימות תחת תנאים זהים.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובות על מבנה הריאה במסגרת קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים של פתולוגיה ריאתית עם נקודות קצה רלוונטיות למחלה לצורך מחקרים טרנסלציונליים.
- שומר על רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני באמצעות סטנדרטיזציה של הכנת הרקמה.
- מפחית את הסיכון לממצאים ארטיפקטואליים שעלולים להטות הערכות של סממנים ביולוגיים או של יעילות.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתונים היסטולוגיים חסונים.
שילוב בצינור העיבוד ובזרימת העבודה
שיטה זו לקיבוע בלחץ קבוע משתלבת ברצף הגילוי המוקדם והתיקוף הפרה-קליני, ותומכת הן בתיקוף המטרה והן בזיהוי מובילים במודלים של מחלות נשימה.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת ארכיטקטורת רקמה אמינה לבדיקת השערות וניתוח מסלולים במודלים של אמפיזמה.
- סריקה: מספקת תוצרי היסטולוגיה כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידות מורפומטריות כגון mean linear intercept ו-destructive index לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמה של ממצאים פרה-קליניים עם פתולוגיה קלינית של אמפיזמה כאשר הדבר רלוונטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה יכולת קיבוע סטנדרטית הניתנת להתאמה למודלים שונים של מחלות ריאה בעכברים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את ביטחון התחזיות ואת תיקוף המטרה על ידי מזעור השונות בקיבוע.
- ערך תפעולי: מגביר את התפוקה והסטנדרטיזציה על ידי מתן אפשרות לקיבוע סימולטני של דגימות מרובות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי תמיכה בנקודות סיום היסטולוגיות חסונות.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכונים של תוכניות למחלות נשימתיות בהתבסס על נתוני רקמה מהימנים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהליכים כירורגיים בעכברים וטיפול ברקאות ריאה.
- נחוש ציוד קיבוע ייעודי המסוגל לשמור על לחץ קבוע.
- דורש סטנדרטיזציה של פרמטרי הקיבוע בין צוותים שונים לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה למקבעים שונים בהתאם לדרישות הניסוי.
- חייב לכלול פרוטוקולי בטיחות לטיפול בחומרי קיבוע מסוכנים.
