הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ

פרוטוקול זה איפשר לדמיין RNA של SARS-CoV-2 בשורות תאים ובתרביות אפיתל תלת תלת מימדיות של דרכי הנשימה האנושיות, ומספק כלי להבנה טובה יותר של פתוגנזה ושכפול ויראלי ברמת התא הבודד. בשל הספציפיות, הרגישות והרזולוציה הגבוהה שלה, שיטה זו שימושית לא רק למחקרים מדעיים בסיסיים של SARS-COVID-2 אלא גם לפרויקטים יישומיים, כגון אבחון. מי שתדגים את ההליך תהיה אגניישקה סודר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.

לאחר קיבוע וחדירה של התאים כמתואר בכתב היד הטקסטואלי, הסר את תמיסת ה-PBS 1X מהבארות, והוסף לפחות 300 מיקרוליטר של מאגר הגברה לכל באר. דגרו את הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הכן כל סיכת ראש HCR על ידי קירור מהיר של הנפח הרצוי בצינורות נפרדים.

להכנת 300 מיקרוליטר של תמיסת הגברה, השתמש ב -18 פיקומולים מכל סיכת ראש. העבירו את תמיסת סיכת הראש לשפופרות, ודגרו אותן בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר מכן מצננים לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.

הכינו תערובת סיכות ראש על ידי הוספת סיכות השיער H1 ו-H2 שהתקררו במהירות למאגר ההגברה. יש להניח טיפות של 30 עד 50 מיקרוליטר של תערובת סיכות ראש על Parafilm. הניחו את הכיסויים עם התאים על טיפות תערובת סיכת השיער, ודגרו את הדגימות למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר.

כדי להרכיב את השקופיות, הנח שתי טיפות של 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על מגלשה, וודא שהטיפות מופרדות מספיק כדי לאפשר להניח שתי החלקות כיסוי על שקופית אחת. הסר עודפי נוזלים על ידי הקשה על הכיסויים על מגבת נקייה. לאחר מכן הנח אותם במדיום הרכבה נגד דהייה כשהתאים פונים כלפי מטה.

הניחו את הדגימות המותקנות על משטח יבש ושטוח בחושך, ותנו להן להתרפא. לאחר קיבוע וחדירה של תאי האנגיואדמה התורשתית כמתואר בכתב היד הטקסטואלי, הגבירו מראש את הדגימות על ידי דגירה עם מאגר הגברה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש ב -30 פיקומולים מכל סיכת ראש להכנת 500 מיקרוליטר של תמיסת הגברה.

העבירו את תמיסת סיכת הראש לצינורות, ודגרו אותם בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר מכן מצננים אותם לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. הכן את תמיסת סיכת הראש על ידי הוספת כל סיכות השיער המקוררות בהצמדה ל-500 מיקרוליטר של מאגר הגברה בטמפרטורת החדר.

הסר את תמיסת ההגברה המוקדמת, והוסף את תמיסת סיכת הראש המלאה. לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך. הנח את הממברנה החתוכה מתוספות Transwell על 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה נגד דהייה כשהתאים פונים כלפי מעלה, והוסף אמצעי הרכבה נוסף לממברנה.

ואז מכסים את הממברנות בכיסויים. פרוטוקול אימונו-RNA-FISH זה בוצע בשתי מערכות תאיות, קו תאי Vero ותרבית אפיתל תלת תלת מימדית של דרכי הנשימה האנושיות. לוקליזציה של RNA תת-גנומי של SARS-coronavirus-2 בתאי Vero נגועים ומחוסנים מוצגת כאן.

ניתן לראות RNA ויראלי באדום. לוקליזציה של RNA תת-גנומי של SARS-coronavirus-2 בתאי אפיתל של דרכי הנשימה האנושיות הנגועות והמחוסנות מוצגת כאן. פרוטוקול החדירות עבר אופטימיזציה בתאי Vero.

חדירה עם חומר ניקוי מביאה לאות ברור וספציפי ל-RNA תת-גנומי של SARS-coronavirus-2, בעוד ששימוש באתנול מביא לתמונה מטושטשת ולא ממוקדת. בעת הרכבת השקופיות עם תאי Vero, חשוב למקם כיסוי כשהתאים פונים כלפי מטה. בעת הרכבת שקופיות האנגיואדמה התורשתית, יש למקם את הממברנה כשהתאים פונים כלפי מעלה.

ניתן לשנות טכניקה זו בקלות כדי לאפשר זיהוי של כל RNA, כולל RNA לא מקודד ווירוסי RNA שעלולים להופיע בעתיד. בשילוב עם אימונופלואורסצנטיות, ניתן להשתמש בו כדי לחקור את האינטראקציות בין חלבון ל-RNA ברמת התא הבודד.