מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

רוב המחקרים עם ליפוזומים מסתמכים על טכניקות נועזות באופן מהותי בהנחה שכל ליפוזומים זהים. על ידי לימוד ליפוזומים בודדים, ניתן לצפות בהומוגניות משמעותיות. טכניקת ליפוזום יחיד המוצג כאן מאפשרים לנו ללמוד מאות ליפוזומים בו זמנית ולזהות inhomogeneities בגודלם והרכבם.

השיטה יכולה בקלות להיות מותאמת ללמוד מערכות אחרות ברמה אחת liposome כגון אינטראקציות קרום חלבון. כל מה שאתה צריך זה את התרכובת שאתה לומד כדי להיות מתויג באופן פלואורסצנטי. עם וידאו זה, אנו מספקים לחוקרים את הכלי על איך הם יכולים לבצע מחקרים ליפוזום יחיד.

אנו מקווים כי ברור כי ניתן לשנות בקלות את ההתמדה כדי ללמוד מגוון נושאים מדעיים אחרים. כדי להתחיל, לערבב את מניות השומנים מוכן 138 microliters של POPC ו 120 microliters של כולסטרול בקבוקון זכוכית טרי. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים כל אחד משני שומנים עם תווית פלואורסצנטית ו-50 מיקרוליטרים של DSPE-PEG-ביוטין.

משחררים את המכסה של בקבוקון הזכוכית ומקפיאים את הבקבוקון בחנקן נוזלי למשך שעה עד שתי דקות. ליופיליזציה של תערובת השומנים הקפואה לילה במייבש הקפאה. בבוקר, מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ D-סורביטול 200 מילימולר לשומנים היבשים.

מחממים את התערובת ל-45 מעלות וחושפים אותה לבחוש מגנטי למשך שעה לפחות. ואז להקפיא את ההשעיה השומנים על ידי טבילת הבקבוקון בחנקן נוזלי ולחכות עד ההשעיה קפואה לחלוטין. לאחר מכן, טובלים את ההשעיה הקפואה באמבט חימום ב 55 מעלות צלזיוס עד התערובת מופשרת לחלוטין.

חשוף את התערובת לסך של 11 מחזורי הפשרת הקפאה. לאחר מכן, באמצעות ערכת שולט מיני, להדר את ההשעיה ליפוזום פעם אחת באמצעות מסנן פוליקרבונט 800 ננומטר. יש לערבב 1, 200 מיקרוליטר של BSA ו-120 מיקרוליטר של ביוטין BSA.

מוסיפים 300 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר במגלשה של שמונה בארות ומדרגים את המגלשה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. להטות מעט את השקופית ומהקצה של כל גם לתומם את המדיום. מיד להוסיף 300 microliters של מאגר HEPES לתוך כל באר לשטוף.

לשטוף כל באר שמונה פעמים בסך הכל. מוסיפים 250 מיקרוליטרים של סטרפטבידין ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שמונה שטיפות כפי שתואר קודם לכן.

מניחים את השקופית על המיקרוסקופ ומתאימים את מוט ההיגוי של המיקרוסקופ כדי להתמקד על פני השטח של התא. זה יכול להיעשות בקלות באמצעות אות השתקפות לייזר מוגברת מממשק מאגר זכוכית כמדריך. בצינור מיקרוצנטריפוגה, להוסיף 10 microliters של מלאי ליפוזום מדולל המכיל 20 שומנים סך micromolar.

מעבירים 100 מיקרוליטרים של חיץ מהתא לצינור המיקרוצנטריפוגה, מערבבים כראוי ומעבירים את 110 המיקרוליטרים בחזרה לתא. שים את התא מתחת למיקרוסקופ ולהשתמש בהגדרת מיקרוסקופ בסיסי המסוגלת לזהות אות מהפלואורופורים של ליפוזום כדי לצפות בליפוזומים משותקים על פני השטח. הגדר את המיקרוסקופ כמתואר בכתב היד.

כדי דימוי הן DOPE ATTO488 ו DOPE ATTO655 פלואורופורים בליפוזומים, תמונה ערוצים מרובים. ודא שכל ערוץ תדמיתו בתמונה ברצף כדי למנוע גירוי צולב. לדוגמה, לצלם תחילה תמונה אחת על ידי מרגש ב 488 ננומטר וקריאת פליטה ב 495 כדי 590 ננומטר.

לאחר מכן, לשנות את ההגדרות ולקחת תמונה אחרת על ידי מרגש ב 633 ננומטר אבל קריאת פליטה רק ב 660 כדי 710 ננומטר. לנתח. בתפריט תמונה, בחרו צבע ולהשתמש בפונקציית ערוץ המיזוג ליצירת שילוב של שני הערוצים. שים לב אם ליפוזומים בתמונה בשני ערוצים שונים להציג שיתוף לוקליזציה טובה או אם סחף גלוי התרחש.

כדי לזהות חלקיקים, פתח את תפריט התוספים, בחר ComDet ולחץ על לזהות חלקיקים. ב- ComDet, ודא שההגדרות נכונות ולחץ על אישור. לאחר הפעלת הניתוח, שני חלונות מוקפצים עם תוצאות ומופע סיכום. טבלת התוצאות מכילה את יחס העוצמה בין שני הערוצים.

יצא את תוצאות טבלת הנתונים המכילות את נתוני ההתאמה שלוקליזציה שותף. התאימו את היסטוגרמת יחס העוצמה עם פונקציה גאוסיאנית וחלץ את הממוצע וסטיית התקן. ניתן להשתמש בסטיית הממוצע והסטנדרט כדי לחשב את מידת האנוהוגניות.

הכינו ניסוח ליפוזום שהובלט מספר פעמים באמצעות מסנן 50 ננומטר. כייל את גודל ליפוזומים על ידי השוואת עוצמת הפלואורסצנטיות לנתונים בגודל מ- DLS. עם אותן הגדרות מיקרוסקופ ניסיוניות כמו בעבר, תדמיין את ליפוזומי הכיול.

התווה היסטוגרמה של עוצמת השורש הריבועי של עוצמת הפלואורסצנטיות של ליפוזומי הכיול. התאם את ההיסטוגרמה עם התפלגות תקינה ביומן וחלץ את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של ליפוזומי הכיול כממוצע הגיאומטרי. כדי לקבוע את הקשר בין עוצמת השורש הריבועי לגודל ליפוזום, חשב את גורם התיקון על-ידי חלוקת קוטר ליפוזום הממוצע המתקבל ממדידות פיזור האור הדינמיות עם הממוצע הגיאומטרי של עוצמת השורש הריבועי.

לחשב ערכי עוצמת שורש ריבועי עבור ליפוזומים בניסוי inhomogeneity הרכב ולהמיר שני קטרים אלה על ידי הכפלה עם גורם התיקון. התווה את ערך יחס האינטנסיביות כפונקציה של קוטר עבור ליפוזומים inhomogeneity הרכבה, ובכך להשיג את inhomogeneity כפונקציה של גודל ליפוזום עבור אוכלוסייה של ליפוזומים המשתרעים על כ 50 ננומטר ל 800 ננומטר. בפרוטוקול זה, קיבוע משטח מוצלח של ליפוזומים היה ברור מיד עם תוספת של פתרון ליפוזום לתא שצוין על ידי כתמים בעוצמה מוגבלת דיפוזיה.

מומלץ לשתק מספיק ליפוזומים כדי להשיג צפיפות של 300 עד 400 ליפוזומים לכל מסגרת. צפיפות נמוכה יותר הופכת את ניתוח הנתונים לאורך זמן רב יותר בעוד שצפיפות גבוהה יותר הופכת את ההבחנה בין ליפוזומים בודדים למאתגרת יותר. אם כל שדה התצוגה אינו נמצא במוקד הנכון, ייתכן שצלחת הדגימה מוטה.

כמו כן, אם ליפוזומים נראים גדולים ומטושטשים, זה מצביע על החיץ בתא אולי התאדה ואת פני השטח התייבש. היסטוגרמות יחס האינטנסיביות חושפות בדרך כלל התפלגות גאוסיאנית סביב ערך יחס ממוצע. אם נצפו סטיות חזקות מהתפלגות גאוסיאנית, הדבר מצביע על בעיית רגישות בזיהוי המצביעה על כך שתת-קבוצה של ליפוזומים המראים אות חלש יותר לא נכללה.

לאחר התאמת היסטוגרמה יחס אינטנסיביות עם פונקציה גאוסיאנית, מידה של ערך inhomogeneity של 0.23 תורגם 32% מהאוכלוסייה שונה על ידי יותר מ 23% מן היחס הטוחן הממוצע של ההרכב. כימות אי הוודאות הניסיונית נמצא 0.1. ההתרגם לעולם לא ישתפר יותר מאשר החומרים שאתה משתמש כל כך ליפוזומים יונילמינאריים באיכות גבוהה הם חיוניים.

לכן, כאשר אתה מכין את אלה, לא לעגל כל פינות כגון השארת מחזורי הפשרה הקפאה. תמונות גרועות יובילו לאי ודאות ניסיונית גבוהה ו לגרום לך להפיג את inhomogeneity אז לקחת את הזמן כדי לרכוש תמונות טובות בפוקוס. מה שההתמדה בעצם עושה הוא לחקור את צפיפות פני השטח של התווית הפלואורסצנטי.

אם תווית פלואורסצנטי זה הוא על שומנים מחורטפים, אז בדיקה זו יכולה לשמש ליפוזומים בדיקת איכות למשלוח סמים. ההתקנה הוחלה כדי ללמוד כיצד פפטידים נקשרים לממברנות ולחוש את העקמומיות. זה נתן לחוקרים תובנות ייחודיות לרמזים המולקולריים השולטים באופן שבו פפטידים ממוינים בתוך תאים.