Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למדוד שינויים בתכונות השכבה הכפולה המושרים על ידי תרופה, כפי שהם נתפסים על ידי חלבונים החוצים את השכבה הכפולה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת LUVs חד-צדדיים טעונים ב-Fluor. השלב השני של הפרוצדורה הוא הוספת gramin לוזיקולות.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת משתיק חיצוני ומדידת קצב השתיקה של הפלואורופור הפנימי. ארבע. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא כימות השינוי בשתיקת הפלואורסצנציה ביחס לפעילות הגרמין, על ידי התאמת פונקציית מעריך מתוחה (stretched exponential function) למהלך הזמן של הפלואורסצנציה. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות להערכה אם amfi files יכולים לשנות את תכונות השכבה הליפידית הכפולה.

שלום, אני אולה אנדרסון. שלום, אני הלסון. היי, אני ריצ'י קאפו.

ואני ליה סנפורד מהמעבדה של ד"ר אולף אנדרסון במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה ב-Weill Cornell Medical College. היום נדגים לכם פרוצדורה למדידת שינויים בתכונות של שכבות ביו-ליפידיות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את ההשפעות של תרופות ומולקולות קטנות על תכונות של שכבות ביו-ליפידיות.

בואו נתחיל. ביום הראשון של פרוצדורה זו, הוציאו את הליפיד מהמקפיא והניחו לו להגיע לטמפרטורת החדר. לאחר ההשוואה לטמפרטורה, הוסיפו 0.6 milliliters של תמיסת ליפיד וכלורופורם בריכוז 25 milligrams per milliliter לבקבוק תחתית עגולה של 25 milliliters. לאחר מכן, ייבשו את התמיסה תחת גז חנקן תוך סיבוב רציף של הבקבוק עד שכל הכלורופורם יתאדה.

שכבה דקה ולבנה של ליפידים מצפה את כל החלק התחתון של הבקבוק; ייבשו את הליפידים עוד יותר בדססיקטור תחת ואקום למשך לילה. הכינו תמיסה של 100 millimolar sodium nitrate, 25 millimolar ANTS ו-10 millimolar HEPs ב-pH 7. בעת כיוון ה-pH של תמיסה זו, הימנעו משימוש בתמיסות המכילות כלוריד.

כיוון שהמכבה (Quencher) טליום יוצר קומפלקס בלתי מסיס עם הכלוריד ביום השני, יש להמיס מחדש את הליפידים ב-1.67 מיליליטר של תמיסת אלקטרוליט זו כדי לקבל סספנזיית ליפידים בריכוז 10 millimolar. לאחר הגעה לריכוז הנכון, יש לכסות ב-para film ולערבב את הסספנזיה היטב במכשיר vortex, להגן על הדגימה מאור באמצעות נייר אלומיניום ולהניח לה להתבגר בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

ביום השלישי, בצעו סוניקציה לתערובת למשך דקה אחת במכשיר סוניקטור בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, בצעו למדגם הפשרה והקפאה (freeze-thaw) על ידי השהייה של חמש דקות על קרח יבש, ולאחריה חמש דקות במים חמים; חזרו על מחזור ההקפאה וההפשרה ארבע עד חמש פעמים. בצעו אקסטרוזיה לתלי השומנים באמצעות mini extruder של חברת Avanti.

הכינו את המיני-אקסטרודר (mini extruder) עם מסנן פוליקרבונט של 0.1 מיקרון ותומכי מסנן; בצעו אקסטרוזיה של הסספנזיה הלוך ושוב 21 פעמים, כך שתתקבל סספנזיה שקופה למדי במזרק הנגדי, ובכך תיווצר סספנזיה של וסיקולות גדולות (LUV - large unilamellar vesicles). הסירו ANTS חיצוני על ידי העברת הסספנזיה שעברה אקסטרוזיה דרך עמודת PD 10 ששומששה עם בופר נתרן. הוסיפו לעמודה 1.5 מיליליטר של סספנזיית ה-LUV בתוספת מיליליטר אחד של בופר נתרן.

לאחר שהתמיסה נספגה במלואה בעמודה, בצעו אלוציה של הליפוזומים באמצעות שלושה מיליליטר של בופר נתרן ואספו את התמיסה שנשטפה. תמיסת המלאי של LUV ממולאים ב-A NTS שנוצרה צריכה להכיל כ-4 עד 5 מילימולר ליפיד ולהיראות שקופה-לבנה.

הגנו על התמיסה מפני אור באמצעות נייר אלומיניום ואחסנו אותה בטמפרטורה של 13 °C. 24 שעות לפני השימוש, ערבבו היטב באמצעות vortex. תמיסת מלאי של LUV ממולאת ב-A NTS. מכיוון של-UUVs יש צפיפות הגבוהה מ-1 g/mL, הם עלולים לשקוע.

לאחר מכן, דללו את תמיסת המלאי של ה-LUV הממולאים ב-A NTS ביחס של 1:20 עם בופר נתרן. דגרו שלושה רבעים מהליפוזומים עם 260 nanogram של abidin ב-DMSO. הוסיפו את אותו הנפח של DMSO ללא gramin לרבע הנותר.

כדי לשמור על ריכוז ממס קבוע בכל הדגימות, יש להמתין עד שה-gramin יגיע לשיווי משקל בין השכבות המונימולקולריות הפנימיות והחיצוניות של וסיקולות הליפידים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 13 degrees Celsius. לשם כך, נעשה שימוש בספקטרו-פלואורימטר מסוג stopped flows דגם applied photophysics SX point 20 עם בקרת טמפרטורה, כדי למדוד את קצב כיבוי הפלואורסצנציה. לתחילת העבודה, הפעילו את המכשירים שעה מראש כדי לאפשר להם להתחמם.

הסבך עם הדיווחים עבור העירור צריך להיות one slash one ויש להשתמש במסנן מעביר גבוה של 455 nanometer להקלטת הפליטה באמצעות תוכנת pro data SX. הגדירו תחילה את תנאי ההקלטה, והגדירו את אורכי גל העירור של המונוכרומטור ל-352 nanometer. השתמשו בהגדרת pressure hold.

הגדירו את הזמן לשנייה אחת ואת מספר הנקודות ל-5,000. התאימו את מספר החזרות לתשעה עבור הרצות באפר ול-13 עבור הרצות עם ממתן (quencher). עקבו אחר הטמפרטורה בפרופיל בדיקת ההנעה של תוכנת Essex.

יש להגדיר את נפח ההנעה ל-120 µL, המהווים תערובת של 60 µL מכל מזרק. הגדרה זו נותנת זמן מת של כ-1.2 ms. יש לכוון את המתח הגבוה או את ההגבר של גלאי הפלואורסצנציה לכ-420 V.

המטרה היא להגיע לקריאת פלואורסצנציה של כ-שמונה; יש להביא את ה-UUVs הטעונים ב-NTS שהוכנו קודם לכן למצב של שיווי משקל במשך 10 דקות ב-25 degrees Celsius בחשיכה. לאחר הגעתם לשיווי משקל, יש לערבב את הדגימה בוורטקס, ולאחר מכן להטעין אותה למזרק השמאלי. למזרק הימני יש להטעין או sodium buffer או thallium Quencher.

הסר בועות אוויר על ידי דחיפת המזרקים קדימה ואחורה. שני המזרקים צריכים להיות טעונים באופן שווה. לפני סגירת השסתומים עבור הדגימה הראשונה, רשום את הפלואורסצנציה עם בופר נתרן.

חזור על הפעולה ארבע פעמים וכוונן את ההגבר (gain) לפי הצורך. לאחר מכן, חזור על הפעולה חמש פעמים נוספות עבור שאר הדגימות. רשום תשע חזרות עם בופר נתרן.

החליפו את תחליל הנתרן במכבה התליום והקליטו 13 חזרות. שטפו במים והמשיכו לבקרות הדגימות הבאות. כללו דגימות ללא gramin ועם ממס, ודגימות ללא gramin עם ריכוז התרכובת המקסימלי.

לאחר ביצוע בדיקת הפלואורסצנציה עבור ה-gramin והממס, הזינו את הנתונים לתוכנת MATLAB לצורך ניתוח. עבור כל דגימה, קראו את כל חזרות הבאפר והמעכב (quencher); ארבע החזרות הראשונות יהיו מזוהמות על ידי מה שהיה קודם לכן בצינוריות. במקרה זה, האות נובע מערבוב של דגימת באפר נתרן עם מים משטיפה קודמת.

חזרות חמש עד תשע מייצגות את האות מהדגימה לבדה. לכן, אנו תמיד מחריגים את ארבע החזרות הראשונות בכל מקרה. כדי למנוע ארטיפקטים של ערבוב, עברו ידנית על העקבות והסירו חזרות פגומות, כגון העקבה האדומה המכילה קפיצות או סטיות הנובעות מארטיפקטים של ערבוב ו/או בועות.

לאחר מכן, נרמלו את החזרות של המהוון (quencher) לממוצע ערכי ההתחלה של חזרות הבאפר עבור כל דגימה בכל תנאי ניסוי, ושלבו את הממוצעים של כל הדגימות לגרף אחד של דגימות ויזואליזציה; דגימות ללא gramine צריכות להיות דומות ולהראות כמעט ללא כיבוי פלואורסצנציה. קיימת הפחתה איטית באות הפלואורסצנציה עקב כניסה איטית של יוני thallium לתוך הוזיקולות עבור דגימות עם gram sidin. אם מהלך הזמן הפלואורסצנטי השתנה באופן נראה לעין על ידי התרכובת, הרי שהתרכובת משנה את תכונות השכבה הליפידה הד双ית בריכוז שנבדק; לאחר מכן, התאימו פונקציית מעריכי מתוח (stretched exponential) ל-100 המילי-שניות הראשונות של עקומות כיבוי הפלואורסצנציה המנורמלות.

עבור החזרות הבודדות, חשבו את הקצב בשני מילישניות. לאחר מכן, חשבו את הממוצעים וסטיות התקן עבור דגימה נתונה מתוך החזרות הבודדות. השפעת ה-capsaicin, המסומן כאן כ-cap, נבחנה על פני מהלך הזמן של כיבוי פלואורסצנציה (fluorescent quenching) בהיעדרו או בנוכחותו של gramin, המסומן כ-ga; אות הפלואורסצנציה הנורמליזציה מוצג כאן לאורך שנייה אחת. נקודות אפורות מייצגות תוצאות מכל החזרות, בעוד שהקווים האדומים הם הממוצעים.

מוצגים 100 המילישניות הראשונות של אות הפלואורסצנציה הנורמלי. הנקודות האפורות הן תוצאות מחזרה בודדת עבור כל תנאי. הקווים האדומים הם התאמות אקספוננציאליות מתוחות (stretched exponential fits) לחזרות אלו.

הקו הכחול המקווקו מסמן את נקודת השנייה השנייה (2 ms). זהו הזמן שבו נקבע קצב ההחסום (quenching). השינוי היחסי בקצב החסום נקבע על ידי נרמול הנתונים אל מול דגימת הביקורת עם gramin ללא מודיפיקטור.

כאשר קפסאיצין נספח לשכבה הליפידית הכפולה, הוא משנה את תכונותיה. השינוי לכיוון שכבה רכה יותר יבוא לידי ביטוי כהסטה בצד הגרם בשיווי המשקל בין מונומר לדימר, לטובת הדימר המוליך. הרגע הצגנו בפניכם פרוצדורה למדידת השפעות ההפרעה של מולקולה קטנה על השכבה הכפולה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בביקורות המתאימות לכל ניסוי תוך שימוש באותה סבב של וזיקולות. זהו כל הפרוצדורה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.