הכנת דגימות ביולוגיות לספקולציה בטמפרטורה קריוגנית באמצעות ספקטרוסקופיה של ספיגת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה

פרוטוקול זה תוקן עבור דגימות תאיות, ומאפשר השוואה של ניסויים הפועלים במיקומים שונים של סינכרוטרון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זרימת עבודה פשוטה ופשוטה המאפשרת שימור מהיר ואמין של האינטגרציה הכימית של הדגימה. אנשים חדשים בטכניקה זו עשויים להתקשות עם התאים הקפואים המתנפחים ועם ההעמסה המהירה של הכדור התאי לסדר הקריוסמפלה.

ניתוק מדויק ומהיר של דגימות בטמפרטורה קריוגנית הוא קריטי. ככזה, הדגמה חזותית היא חיונית כדי להבין כיצד לבצע את הטכניקה. כדי להכין את כדוריות התאים של הערמונית האנושית ותאי סרטן השחלות לצורך דגימת סלניום, זרעו את המספר המתאים של תאים מכל קו תאים לשלושה צלוחיות T-75 לכל מצב במדיום תרבית התאים המתאים במכסה המנוע של זרימה למינרית והניחו את הצלוחיות לתוך אינקובטור תרביות תאים של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד שהתאים נפגשים ב-80%.

כדי לחשוף את התאים הסרטניים לטיפול בסלניום, תחילה תמיסות מלאי ננו-חלקיקים טריים שהוכנו באמבטיית מים באולטרסאונד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני דילול סדרתי של תמיסת הננו-חלקיקים של סלניום במדיום תרבית תאים מלאה לריכוזי העבודה המתאימים. במכסה הזרימה הלמינרי, לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטרים של 37 מעלות צלזיוס PBS לכל שטיפה ולהשתמש בפיפטה סטרילית של 25 מיליליטר כדי להוסיף בזהירות 15 מיליליטרים של טיפול סלניום של עניין לתחתית הבקבוקון. סגרו את המכסים מבלי לאטום לחלוטין את הבקבוקון והניחו את הצלוחיות אופקית בחממת תרביות התאים למשך 24 שעות.

כדי להכין את כדורי התא לאחר הכביסה וחידוש מדיום התרבית, השתמשו במגרד תאים אחד לכל בקבוקון כדי לנתק בעדינות את התאים. השתמש במדיום כדי לשטוף את כל התאים שנדבקו לצלוחית לתוך הסופרנטנט ולאסוף את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה. שטפו את הכדורים פעמיים בחמישה מיליליטרים של PBS לכל צינור לכל שטיפה כדי להסיר את כל העקבות הנותרים של הטיפול ולהחיות את התאים במיליליטר אחד של PBS.

מעבירים את התאים לצינור פוליפרופילן של 1.5 מיליליטר ואוספים את התאים בצנטריפוגה נוספת. לאחר מכן השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר בעדינות את כל הסופרנטנט ולהטביע את החלק התחתון של כל צינור 1.5 מיליליטר לתוך חנקן נוזלי עד לרמה של גלולת התא. מיד לאחר ההקפאה, העבירו את הצינורות לתוך תפירת חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

עבור ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה, יש לייעל את כל הגבישים מהספקטרומטר של מנתח הגבישים בתנאי בראג ביחס לאנרגיית קו הפלואורסצנציה המעניינת, והשתמשו בהתייחסות שעבורה מיקום האנרגיה של קצה הבליעה ידוע כמכויל את אנרגיית הקרן המונוכרומטית של האירוע. מעבירים את בעל הדגימה להליום קריוסטאט נוזלי לדגימות ביולוגיות ומניחים את הקריוסטט ל-10 מעלות קלווין, ואז סוגרים את ההאץ' הניסיוני בהתאם לכללי הבטיחות של הסינכרוטרון, ומתחילים בניתוח. כאן, ספקטרוסקופיית ספיגת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה מייצגת ספקטרום של הסלניום במצב ההתחלתי ובתאים המדוגרים למדיום תזונתי מדגימה כי הסלניום בננו-חלקיקי הסלניום הראשוניים היה נוכח הן כצורות סלניום אפס והן כצורות דמויות צלוליטיס.

עם זאת, לאחר אינטראקציות עם תאי PC3, הסלניום היה נוכח בעיקר בתאים כסלניום אפס, מה שהדגים שינוי של מיני סלניום בתוך התאים. עבור ברזל, ספקטרוסקופיית ייחוס של קליטת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה מציגה מיקומי קצה שונים בהתאם למצב חמצון הברזל, כאשר מינים מופחתים של ברזל מועברים לערכי אנרגיה נמוכים. שני ספקטרום רצופים שנאספו על אותה תנוחה של כדור דיאטום היו דומים, מה שמעיד על כך שהנזק לקורה היה מוגבל בין שתי רכישות בעת שימוש בקריוסטאט הליום ב-10 קלווין.

יתר על כן, ספקטרום ממיקומים שונים של גלולת הדיאטום היו זהים, מה שהוכיח כי גלולת הדגימה הייתה הומוגנית וכי ניתן לממוצע את הספקטרום כדי לקבל ספקטרום יחס אות לרעש טוב יותר. הצעדים הקריטיים ביותר הם הכנת דילטויון הננו-חלקיקים, גלולה בטמפרטורה קריוגנית, והכנת דגימות הייחוס הסטנדרטיות. ניתן ליישם הליך זה על טכניקות אנליטיות אחרות בתפזורת, כגון ICP-MS או HPLC-ICP-MS או טכניקות ספקטרוסקופיות אחרות שאינן סינכרוטרוניות המסוגלות להתבצע בצורה בטמפרטורה קריוגנית.

ניתן לבחון שאלות מדעיות אחרות באמצעות הליך זה, במיוחד בתחומי הביוגיאולוגיה, הביוכימיה ומדעי הסביבה או מחקר הטוקסיקולוגיה. תרכובות סלניום וננו-חלקיקי סלניום יכולים להיות מפרכים לבריאותכם ויש לתמרן אותם במכסה מנוע כימי ייעודי באמצעות כפפות, משקפיים ומסכת פנים.