הערכה מורפולוגית ופונקציונלית של Axons וסינפסות שלהם במהלך מוות Axons בדרוסופילה מלאנוסטר
16 במרץ 2020
כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע שלושה המושרה הנגרמת לפציעה מניוון (אקסון מוות) בחני ילה melanogaster כדי להעריך את השימור מורפולוגית ופונקציונלית של אקסונים קטוע הסינפסות שלהם.
המטרה הכוללת של פרוטוקול פציעה דרוסופילה זה היא לבחון הן את השימור של מורפולוגיה אקסונאלית סינפטית, כמו גם תפקוד סינפטי של אקסונים הסינפסות שלהם. אלה assays יכול לשמש גם כדי לאפיין גורמי תחזוקה עצביים, ללמוד תחבורה אקסונלית, או לנתח organelles אקסונאלי האקסונים שלמים. הפציעה החלקית בכנף מאפשרת תצפית של אקסונים פצועים שעוברים ניוון זה לצד זה עם אקסונים שליטה לא פצועים בתוך אותו צרור עצבים באגף דרוסופילה.
בדיקה פציעה זו ניתן לתרגל בקלות מראש זבובים מסוג פראי על ידי החלת חתך בערך באמצע הכנף עם מיקרו מספריים. הפגיעה הפנימית מאפשרת הערכה של מורפולוגיה אקסונאלית ועל ידי שימוש באופטוגנטיקה כדי לדמיין שימור תפקודי של אקסון והתקצירים שלהם. אבלציה של אנטנות דורשת ידיים יציבות.
מומלץ גם לתרגל את הסרת האנטנות בזבובים מסוג פראי מראש. בהתמכרות, כל התקנה אופטוגנטיקה זמינה מתאימה להפעלת הנוירונים לטוס עם כובע. אחרת, התקנה פשוטה יכולה להיבנות בקלות מאפס.
כדי להתחיל, השתמש חמש נקבות בתולה וחמישה זכרים מן הגנוטיפ הנכון לבצע צלבים בטמפרטורת החדר. העבר את דור ה-P0 לבקבוקונים חדשים כל שלושה עד ארבעה ימים. לאסוף דור F1 מבוגר eclosed טרי מדי יום לתוך בקבוקונים חדשים גיל אותם במשך שבעה עד 14 ימים.
לאחר הרדמה, השתמש במיקרו מספריים כדי לחתוך את וריד הכנף הפנימי בערך באמצע הכנף. השתמש בכנף אחת לפציעה ובאגף השני כגיל תואם שליטה לא פצועה. יש למרוח פציעה אחת בכל כנף ולוודא ש-15 כנפיים נפצעו.
לשחזר את הזבובים במזון המכיל בקבוקונים. לאחר מכן, עם פיפטה, להפיץ 10 microliters של שמן halocarbon 27 לאורך מגלשת זכוכית שלמה. יום או שבעה ימים לאחר פציעה, השתמש במיקרו-מספריים כדי לנתק את הפצועים, כמו גם את כנף הבקרה הבלתי פצועה.
השתמש פינצטה לתפוס את הכנף במרכז, הר מקסימום ארבע כנפיים לתוך שמן halocarbon 27 ולכסות אותם עם מגלשת כיסוי. תמונות של נוירונים המסווים GFP בכנף ניתן לרכוש בקלות עם דיסק מסתובב. עם זאת, זמן הרכישה צריך להתבצע בתוך פחות משמונה דקות לאחר הרכבה על הכנפיים כי המנה אינה קבועה.
תדמיין את הכנף מיד באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב. רכוש סדרה של מקטעים אופטיים לאורך ציר Z עם גודל צעד 0.33 מיקרומטר ודחוס ערימות Z לקובץ יחיד לניתוחים הבאים. לחצות חמש נקבות בתולות וחמישה זכרים מהגנוטיפ הנכון ולאסוף דור F1 כבעבר.
לאחר הרדמה, השתמש פינצטה כדי להפוך את קטע האנטנות השלישי הימני עבור אבלציה חד צדדית או שני מקטעי אנטנות שלישית שמאלה וימינה עבור אבלציה דו-צדדית. פעולה זו מסירה GFP שכותרתו גופי תאים עצביים בעוד התחזיות האקסונאליות שלהם להישאר מערכת העצבים המרכזית. בהתאם לנוירונים המסומן GFP המשמשים בטכניקה, חשוב לדעת אם גופי התא שוכנים בשלישי או במקטע האנטנה השני לצורך הפציעה הבאה.
לשחזר את הזבובים במזון המכיל בקבוקונים. לאחר הרדמה, השתמש פינצטה לתפוס את הצוואר פינצטה נוספת כדי לתקן את בית החזה. משוך בעדינות את הצוואר ואת הראש את בית החזה.
באמצעות פינצטה כי כבר טבול לתוך פתרון התיקון, להעביר את כל הראשים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של פתרון תיקון של 4%paraformaldehyde ו 0.1 טריטון X100 ב PBS. תקן את הראשים במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. ואז לשים את צינור microcentrifuge על קרח ואת הראשים נמשכים לתחתית צינור microcentrifuge.
הסר את העל-טבעי עם פיפטה והוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה המכיל 0.1% טריטון X100 ב- PBS. מניחים את הצינור על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר כדי לשטוף במשך שתי דקות. חזור על לשטוף ארבע פעמים נוספות כדי להסיר פתרון תיקון שיורית.
לאחר הכנת המוח, להשיג שקופית כיסוי, לתקוע קלטת מעבדה על זה, ולגזור צורה כמו T מהקלטת. השתמש 20 כדי 200 טיפ פיפטה microliter שבו שלושה מילימטרים של הקצה נותק כדי להרחיב את הפתיחה של פיפטה. פיפטה המוח המכיל reagent antifade על השקופית ולכסות את המוח עם שקופית כיסוי.
השתמש חימר להכין שני לחמניות אפילו קטנות. ודא כי לחמניות חימר אינם גבוהים יותר מגובה של מגלשת זכוכית. תקע את גלילי החימר על מגלשת הזכוכית והצב את המוח המכיל כריך שקופיות כיסוי על לחמניות החימר.
המשך בהתאם לכתב היד. כדי להכין את הזבובים לאופטוגנטיקה, ראשית להמיס מזון זבוב במיקרוגל. לאחר שהמזון מתקרר, לפני ההתמצמות, מוסיפים 20 מילימולר כל טרנס-רטינאלי באתנול לריכוז סופי של 200 מיקרומולר.
מערבבים היטב ויוצקים את האוכל מיד לתוך בקבוקונים ריקים. מכסים את הבקבוקונים המכילים את האוכל המוצק בתקעים או כדורי כותנה. עוטפים את הבקבוקונים בנייר אלומיניום.
לאחר מכן, לאחסן את האוכל המכיל בקבוקונים בחדר קר כהה. השתמש חמש נקבות בתולה וחמישה זכרים מן הגנוטיפ הנכון לבצע צלבים בטמפרטורת החדר ולאסוף דור F1 כמו בעבר בקבוקונים מכוסים אלומיניום המכיל 200 micromolar כל trans-Retinal במזון זבוב. לאחר מכן, לאסוף את הזבובים על ידי הקשה עליהם ממזון המכיל בקבוקונים לתוך בקבוקון ריק ללא מזון.
מקררים את הבקבוקון בקרח המכיל מים למשך כ-30 שניות. זבובים נרדמים. עכשיו, במהירות לשים זבובים בודדים לתוך תאים קטנים מכוסה שקופית כיסוי לבצע אופטוגנטיקה.
בחדר חשוך, בצע את הפרוטוקול המורכב 30 שניות שבו האור האדום נעדר, ואחריו 10 שניות של חשיפה לאור אדום ב 10 הרץ. חזור על הליך זה שלוש פעמים בסך הכל ואחריו מרווח נוסף של 30 שניות שבו האור האדום נעדר. לאסוף זבובים בודדים מכל תא על רפידות פחמן דו חמצני.
כדי לחשוף אותם לפגיעה באנטנות, יש להפוך הן את מקטעי האנטנות השמאלית והן את מקטעי האנטנה השניים הימניים. זה מסיר את גופי התא של נוירוני האיברים של ג'ונסטון בעוד התחזיות האקסונאליות נשארות ב- CNS. לשחזר את הזבובים בבקבוקונים מכוסים אלומיניום המכיל 200 מילימולר כל טרנס-רשתית.
בנקודות זמן מקבילות, למשל שבעה ימים לאחר אבלציה אנטנות, לחשוף את הזבובים לתחת טיפוח אחר. בפרוטוקול זה הוצגו שלוש שיטות לחקר המורפולוגיה והתפקוד של אקסונים כרותים ואת הסינפסות שלהם. השיטה הראשונה מאפשרת תצפית ברזולוציה גבוהה של אקסונים בודדים במערכת העצבים ההיקפית.
הצלבים סכמטיים כדי ליצור שיבוטים מסוג פראי highwire בכנף מוצג כאן. השליטה באקסונים פצועים עם תווית GFP מוצגים גם עם חצים המציינים אקסונים כרותים. הגישה השנייה לחקר מוות אקסון של GFP שכותרתו אקסונים נוירון חושי במוח מוצג.
צלבים סכמטיים כדי ליצור שיבוטים מסוג פראי ו highwire במוח מוצג כאן. דוגמאות לשליטה באקסונים בעלי תווית GFP פצועה מוצגות עם חצים המציינים חבילות אקסון מנותקות. השיטה השלישית מדגימה את הגישה לדמיין פונקציה אקסונאלית וסינאפטית לאחר אקסוטומיה.
הצלבים סכמטיים כדי ליצור סוג פראי ו dnmnat מעל להביע נוירונים חושיים איברים של ג'ונסטון מוצג כאן. זבובים מסוג פראי הם זבובים המכילים את תאי העצב באיברים של ג'ונסטון עם מוות אקסון מקוצר. שניהם היו בעלי התנהגות טיפוח חזקה לפני פציעה.
עם זאת, שבעה ימים לאחר פציעה, הטיפוח לא עורר אופטוגנטיקה בזבובים מסוג בר, בעוד בעלי החיים עם מוות אקסון מקוצר המשיכו לטפח. כאן אנו משתמשים באובדן מוטציות תפקודיות או בביטוי הגנים שלנו כדי לבחון את שימור המורפולוגיה האקסונאלית או התפקוד הסינפטי. ניתן ליישם שיטות שינוי אחרות, כגון הפרעת RNA או נוקאאוטים מתווכים ספציפיים לרקמות CRISPR-Cas9.
ניתן להשתמש בשיטות אלה בהקשר בלתי תלוי בפציעה. הם מאפשרים תצפית ואפיון של גורמי תחזוקה עצביים במהלך ההזדקנות, הובלה אקסונלית, ואברונים אקסונאליים באקסונים שלמים.
סקירה כללית
מחקר זה מספק פרוטוקולים לביצוע בדיקות של דגנרציה אקסונית מושרית פגיעה ב- Drosophila melanogaster, תוך התמקדות בהערכת השימור המורפולוגי והתפקודי של אקסונים שנקטעו ושל הסינפסות שלהם. הבדיקות נועדו להבנת גורמי תחזוקה נוירונליים ולהערכת הובלה אקסונית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ניוון אקסונלי
- תחזוקה נוירונלית
רקע
- ניוון אקסונים ותחזוקה סינפטית הם קריטיים לבריאות הנוירונלית.
- Drosophila melanogaster משמשת כמודל יעיל לחקר תהליכים אלו.
- הבנת התפקוד הסינפטי לאחר פגיעה עשויה לספק תובנות לגבי מחלות נוירודגנרטיביות.
- מחקרים קודמים הדגישו את חשיבותם של גורמי תחזוקה נוירונליים.
מטרת המחקר
- לקבוע כיצד פגיעה משפיעה על המורפולוגיה והתפקוד האקסונליים והסינפטיים.
- לאפיין גורמים התורמים לתחזוקה נוירונלית.
- לאפשר את ניתוח ההובלה האקסונלית ואברוני המבנה באקסונים שלמים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפרוטוקולים כוללים ביצוע בדיקות לפגיעות אקסוניות ודימיון תאי.
- המודל הביולוגי המשמש הוא Drosophila melanogaster, תוך התמקדות בפגיעות אקסוניות ובהערכות ההחלמה העוקבות.
- בטקסט לא מוזכרים תהליכי עבודה של מולטי-אומיקה (multiomics).
- שלבים מרכזיים כוללים ביצוע פגיעות מדויקות בכנף ושימוש באופטוגנטיקה להדמיית פעילות נוירונלית.
- הפגיעות מוערכות באמצעות טכניקות דימיון עם סימון GFP וניתוח קפדני של מאפיינים סינפטיים.
תוצאות עיקריות
- השיטות מאפשרות בהצלחה השוואה מקבילה של אקסונים פגועים ואקסונים שאינם פגועים.
- ניתן להפיק תובנות משמעותיות בנוגע לשימור התפקוד הסינפטי לאחר פגיעה.
- המחקר מדגים לוחות זמנים קריטיים לרכישת תמונות כדי להבטיח הערכות מורפולוגיות מדויקות.
- המסקנות מדגישות את החשיבות של הבנת התגובות הנוירונליות לפגיעה ומנגנוני תיקון פוטנציאליים.
מסקנות
- מחקר זה מספק פרוטוקולים בעלי ערך להערכת פגיעה אקסונלית ומנגנוני התאוששות באורגניזם מודל.
- התוצאות מקדמות מחקרים נוספים על בריאות נוירונלית, תגובות לפגיעה ותחזוקה סינפטית.
- מודגשות השלכות להבנת מצבים נוירודגנרטיביים ותובנות טיפוליות פוטנציאליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת המנגנונים של דגנרציה של אקסונים היא קריטית להפחתת סיכונים במטרות של מחלות ניווניות של מערכת העצבים ולזיהוי אסטרטגיות לנוירופרוטקציה. פרוטוקולי ה-Drosophila הללו מאפשרים הערכה מנגנונית של שימור אקסוני וסינפטי, ובכך תומכים בתיקוף מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים. הבדיקות מספקות השוואה כמותית, זה לצד זה, של פנוטיפים של דגנרציה והגנה, ובכך מגבירות את הביטחון החזוי בזיהוי מועמדים מובילים (leads).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות הערכה של מורפולוגיה אקסונלית וסינפטית לאחר פגיעה.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות הערכה אופטוגנטית של תמסורת סינפטית באקסונים קטועים.
- ערך תפעולי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות שימוש במודלים של איבוד תפקוד ב-highwire ובביטוי יתר של dnmnat המעכבים את מות האקסון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר מודלים סטנדרטיים וניתנים לשחזור של פגיעה אקסונית עם בקרות פנימיות (אקסונים פגועים לעומת אקסונים שאינם פגועים באותו צרור עצבים).
- ערך תפעולי: מאפשר דימוי ברזולוציה גבוהה של אקסונים המסומנים ב-GFP לצורך כימות והשוואה של המורפולוגיה.
- ערך תפעולי: תומך במוכנות של הבדיקה לסריקת גורמי תחזוקה נוירונליים, הובלה אקסונית ודינמיקה של אברונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר קסקדות איתות של מוות אקסוני השמורות מזבובים ועד ליונקים.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה של שימור תפקוד סינפטי באמצעות התנהגות טיפוח המונחית אופטוגנית כמדד תפקודי.
- ערך תפעולי: תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי קורלציה בין שימור מורפולוגי לבין תפוקה תפקודית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים לתיקוף מטרות, זיהוי מובילים (leads) והערכה פרה-קלינית של מועמדים לנוירופרוטקציה. היא מאפשרת בדיקת השערות לגבי מסלולים של דגנרציה אקסונלית ותומכת בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בהתבסס על נתונים של שימור מורפולוגי ותפקודי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובצמצום סיכונים מכניסטיים של קסקדות איתות של מוות אקסוני באמצעות הפרעות גנטיות ופארמקולוגיות.
- סריקה: מספקת פלטים מורפולוגיים כמותיים ומדדים סינפטיים פונקציונליים להערכת תרכובות או מודיפיקטורים גנטיים.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה ראשית לראשית בין אקסונים פגועים לאקסונים של ביקורת בתוך סביבות זהות, מה שמפחית את השונות ומשפר את מהימנות הנתונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מנגנוני מוות אקסוני ב-Drosophila למודלים של מחלות נוירודגנרטיביות ביונקים דרך מסלולים שמורים כגון Sarm ו-DLK.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר למחקר גורמי תחזוקה נוירונליים, הובלה אקסונית ובריאות מיטוכונדריאלית על פני פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי קישור שימור אקסוני לתוצאות סינפטיות תפקודיות.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות סטנדרטיות וניתנות לשחזור עם בקרות פנימיות המפחיתות רעש ניסיוני ומשפרות את התפוקה.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתחם הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות נוירופרוטקטיביות לפני מחקרים יקרים ביונקים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת ראיות מכניסטיות למעורבות המטרה במסלולי הגנה על אקסונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, נוירו-אנטומיה וטכניקות של מיקרו-כירורגיה לצורך פגיעה מדויקת בכנף או בתחושה (antennal injury).
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (למשל, spinning disk confocal) לצילום אקסונים ברזולוציה גבוהה.
- מצריך מערך אופטוגנטי עם פרוטוקולי הזנה רשתית וגירוי אור פונקציונלי לבדיקות סינפטיות.
- כולל סטנדרטיזציה בין מעבדות עבור תזמון הפגיעה, טיפול בגנוטיפים ובקרות סביבתיות כדי להבטיח הדירות (reproducibility).
- מוגבל על ידי הצורך במידול של פגיעה חריפה (acute injury); מודלים של דגנרציה כרונית עשויים לדרוש גישות חלופיות.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:28
Observation of Axon Morphology During Axon Death in the PNS (Peripheral Nervous System)
3:22
Observation of Axon and Synapse Morphology During Axon Death in the CNS (Central Nervous System)
7:56
Results: Axon Death of GFP-Labeled Sensory Neuron Axons and Axonal/Synaptic Function After Axotomy
9:40
Conclusion
5:53
Grooming Induced by Optogenetics as a Readout for Axon and Synapse Function
