אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית
27 במרץ 2020
הדמיה של מסכי החיים של הקרינה הפלואורסצנטית, כימות ומבדיל את נטיות הצבירה של חלבונים בחיים, הזדקנות, והדגיש מודלים של מחלות C.
השיטה מאפשרת לנו להבחין בבירור בין מבני חלבון עמילואיד משולבים לבין המקבילים המסיסים ואף המצטברים. הטכניקה מבוצעת ב vivo באופן פולשני עם מעט או ללא תופעות לוואי רעילות. כפי שהוא תלוי במאפיינים הפלואורסצנטיים של הפלואורופור עצמו, הוא חזק מאוד והתרבות לאורך זמן.
FLIM נוצל בתחום אבחון סרטן. עם זאת, אנו מעסיקים אותו כדי ללמוד את המנגנונים הבסיסיים של צבירת חלבונים אשר אכן רלוונטיים למחלות ניווניות. המתודולוגיה יכולה לשמש בתחום צבירת החלבון.
כל עוד החלבון הקשור למחלה מתויג עם בדיקה פלואורסצנטית, ניתן לעקוב אחריו ולנטר אותו לאורך זמן. ניתן ללמוד בהצלחה תרכובות ואסטרטגיות המקדמות או מונעות צבירה. כל מערכת ביולוגית המאפשרת להיות חזותית על ידי מיקרוסקופיה אור מתאים FLIM או vivo או ex vivo, למשל בתרבות התא, בדגימות מקובעות או מחלחלות ובכל מדיום הכרחי.
הקפד לבדוק את המאפיינים של הפלואורופור שבחרת בתוך nematode לפני קבלת נתונים ניסיוניים כדי לבדוק כי ההתקנה מתפקדת באופן מלא לפני רכישת מדידות. כדי להתחיל, לגדול ולתחזק nematodes ב 20 מעלות צלזיוס על לוחות NGM. גיל nematodes עד היום הרביעי של החיים כמו הצעירים ואת היום השמיני של החיים כמו המבוגרים.
ביום ההדמיה, התחל בהכנת שקופיות ההדמיה. מניחים אגרוז ומים מזוקקים כפולים בריכוז של 3% משקל לפי נפח. מעבירים אותו למיקרוגל כדי להמיס ולאחר מכן נותנים לו להתקרר מעט.
חותכים את הקצה של קצה פיפיטר אחד מיליליטר ולקחת בערך 200 microliters של אגרוז נמס. פיפטה התעוררה על מגלשת זכוכית נקייה ומיד מניחה שנייה על גבי הימנעות היווצרות של בועות כלשהן. השאר את השקופיות להתייבש בעדינות להסיר את החלק העליון זכוכית.
התוצאה היא מגלשת זכוכית עם משטח אפילו agarose שבו nematodes יהיה ממוקם. לאחר הגדרת ההדמיה מוכנה לשימוש, עובד תחת מיקרוסקופ סטריאו, מניחים טיפה 10 microliter של תרכובת הרדמה על כרית אגרוז בעדינות להעביר חמישה עד 10 nematodes לתוכו. השתמש בקצה עפעף כדי להפריד את nematodes.
שמור אותם קרוב זה לזה אך לא נוגע כדי לאפשר לוקליזציה קלה יותר של nematodes במהלך רכישת תמונה. בזהירות כיסוי nematodes עם כיסוי. תוך שעה לאחר ההרכבה, יש ליי לקחת מדידות.
ודא nematodes הם חסרי תנועה לחלוטין. פתח את תוכנת הרכישה של FLIM. אתר את לחצן הכרטיסיה ולחץ על הפוך פלט לזמין.
מקם את השקופית עם C.elegans רכוב על הבמה באמצעות עדשת הגדלה 10X במצב שידור, לוקליזציה את המיקום של nematodes על השקופית. הסר את השקופית, העבר את המטרה לעדשת הגדלה של פי 63 והחל את מדיום הטבילה הנדרש. מקם את השקופית על הבמה והפוך את הנומטודות לאוקליזציה.
תתחיל לסרוק את הדגימה. בחר אזור מעניין והתמקד במישור ההקרנה המרבי שלו. בממשק של תוכנת FLIM, הצג בתצוגה מקדימה את מספר הפוטונים שזוהו.
ערך ה- ADC צריך להיות בין 10 ל- 10 לערך הרביעי וערך אחד 10 עד החמישי. במידת הצורך, הסט את המיקוד במישור אחר או הגדל את כוח הלייזר כדי לאסוף יותר פוטונים. הקפד להימנע ערימת פוטון אבל לאסוף כמות מספקת של פוטונים כדי ליצור התאמה חיים טובה ומדידה.
שורת התפריטים, בחר בכרטיסיה כדי להגדיר את פרמטרי הרכישה. בחר סינכרון סריקה כדי לאפשר זיהוי פוטון יחיד. הגדר את הרכישה לכמות קבועה של זמן או למספר קבוע של פוטונים.
לחץ להתחיל ברכישה. לפתוח את התוכנה ולייבא קבצי נתונים FLIM באמצעות קובץ, לטעון נתוני FLIM. טען את כל הדגימות מתנאי אחד גם אם הושג בפגישות שונות וחוזר ביולוגי שונה.
במידת הצורך, פלח כדי לאותת nematode עבור תמונת FLIM רבים באמצעות פילוח, מנהל פילוח. גררו את כלי החיתוך מסביב לאזור העניין עד שיסומן. לאחר השלמת הפעולה, לחץ על אישור. בחרו אזור קטן שבו מופיעה תמונה מבוססת עוצמה של C.elegans.
עקומת הריקבון של אזור זה מופיעה בחלון הריקבון הגדול בצד ימין של הממשק. כדי לשער את אורך החיים, בכרטיסיה נתונים, הגדר ערך מינימלי משולב שרירותי בין 40 ל- 300 כדי לא לכלול פיקסלים עמומים מכדי להפיק התאמה טובה. בחר מספר זמן מינימלי ומקסימום זמן כדי להגביל את אות FLIM לערכים אלה.
אל תשנה את הקבעה המוגדרת מראש סופר פוטון של אחד. הזן את שיעור החזרה במגה-הרץ של הלייזר המשמש במהלך הרכישה. הזן ערך מרבי של שער כדי לא לכלול את כל הפיקסלים הרוויים.
בכרטיסיה אורך חיים, בחר התאמה כלליה לשימוש. אל תשנה פרמטר אחר מלבד מספר הבחירה המעריכית אם ידוע כי ריקבון הפלואורסצנטיות שנבחר הוא רב-מעריכי ומציג יותר מחיים שלמים. העלה את ה- IRF באמצעות תפריט IRF.
כדי להעריך את הסטת ה- IRF, בחר IRF, היסוף העברת IRF. קבוצת ערכים מופיעה באופן אוטומטי בכרטיסיה IRF. לאחר שכך נוצר, אל תשנה פרמטרים אחרים של כרטיסיה זו.
לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על התאם ערכת נתונים. מתאים וכתוצאה מכך מסומן בקו כחול צריך לחפוף עם כל האירועים. התאמה טובה מתקבלת כאשר כל האירועים מיושרים לאורך מתאים.
לחץ על כרטיסיית הפרמטרים הממוקמת בתוך התפריטים השמאליים העליונים של ממשק התוכנה ובחר ממוצע סטטיסטי משוקלל ובדוק שהערך הריבועי של הצ'י קרוב ככל האפשר לערך. ערך החיים של התמונה שנבחרה מתגלה כך כערך טאו אחד. יצא כל מידע מעניין באמצעות קובץ, לייצא תמונות בעוצמה, להתאים את טבלת התוצאות, תמונות, היסטוגרמות.
מפות מייצגות של C.elegans המביעים שרירי Q40 RFP ביום הרביעי או יום שמונה של החיים מוצגים כאן. מתיחת Q הארוכה יותר של ה- IQ85 הייתה נוטה יותר לצבירה והפגינו שינוי חיים פלואורסצנטי בהיסטוגרמה כבר ביום הרביעי לחיים. למעשה, ביום הרביעי, היווצרות foci נצפתה עבור IQ85 בעוד עדיין נעדר IQ44.
עם ההזדקנות, עם זאת, IQ44 הפגין גם היווצרות מוקדי ובכך חיים פלואורסצנטיים מופחתים. לבסוף, היווצרות foci לא זוהה ולא ירד אורך החיים פלואורסצנטי בזן NQ40CFP. עבור זן זה, היו רק שינויים עדינים ולא משמעותיים לכל החיים הפלואורסצנטיים הממוצעים עם ההזדקנות.
לאחר המודל nematode הוקמה, כמות הפוטון שנאסף הוא בעל חשיבות עליונה כדי להשיג התאמה טובה לכל החיים. השיטה יכולה להיות סיוב עוד יותר עם טכניקות שונות כגון העברת אנרגיה תהודה פורסטר, FRET, התאוששות פלואורסצנטיות לאחר photobleaching, FRAP, או מדידה. כל ההתאמות הללו מספקות מידע נוסף על תכונות מחקרי החלבון וצורתו המצטברת.
בתחום צבירת החלבון והונוסטזיס החלבון, הטכניקה אפשרה לחקור כל הפרעה המוטלת על המערכת, התפלגות מיני חלבון שונים, ואת הסחר ובהחלט את ההבדל והמשמעות של שברי חלבון מסיסים ובלתי מסיסים בתוך האורגניזם החי. נתרן אזיד הרדמה הוא רעיל ויש לטפל בו עם כפפות ומ המשקפיים ומדולל מתחת למכסה המנוע של האדים. מכיוון שהטכניקה מבוססת מיקרוסקופיה, חשוב לעקוב אחר כל האזהרות הקשורות לעבודה עם לייזרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה משתמש בדימות אורך חיים של פלואורסצנציה (FLIM) כדי לנטר ולכמת אגרגציה של חלבונים במודלים חיים של C. elegans. טכניקה זו מאפשרת תצפית לא פולשנית על מבני חלבונים הרלוונטיים למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- אגרגציה של חלבונים היא מאפיין מרכזי במחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- שיטת FLIM מספקת דרך להבחין בין מצבים שונים של חלבונים.
- הטכניקה מבוצעת in vivo עם רעילות מינימלית.
- ל-FLIM ישנם יישומים מעבר למדעי המוח, כולל אבחון סרטן.
מטרת המחקר
- לחקירה של מנגנוני אגרגציה של חלבונים.
- להבחנה בין מבני עמילואיד אינטגרטיביים לבין חלבונים מסיסים.
- ליישום FLIM בהקשר של הזדקנות ועקה במודלים של C. elegans.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימות אורך חיי פלואורסצנציה (FLIM)
- דימות In vivo של C. elegans
- טכניקות תצפית לא פולשניות
- ניתוח דינמיקה של אגרגציה של חלבונים
תוצאות עיקריות
- בידול מוצלח של מבני חלבוני עמילואיד ממקביליהם המסיסים.
- הדגמה של חסון (robustness) ויכולת שחזור של FLIM לאורך זמן.
- הדגשת הרלוונטיות של אגרגציה של חלבונים למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- הצגת תופעות לוואי רעילות מינימליות של טכניקת הדימות.
מסקנות
- FLIM הוא כלי בעל ערך לחקר אגרגציה של חלבונים באורגניזמים חיים.
- השיטה יכולה לשפר את ההבנה של מנגנונים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומים אחרים, כולל מחקר סרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות זמן חיים של פלואורסצנציה (FLIM) מאפשר ניטור כמותי ולא פולשני של פיבריליזציית עמילואיד במודלים חיים, ובכך תומך בתיקוף מטרה (target validation) ובצמצום סיכונים מנגנוניים בתוכניות למחקר מחלות ניוरोדגנרטיביות. על ידי הבחנה בין מבני עמילואיד אינטגרליים לבין מינים מסיסים ללא צורך בצביעה, FLIM מספק ביטחון חיזוי בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם. העמידות והשחזוריות של השיטה מקלות על שיתוף פעולה רב-תחומי ועל פיתוח סריקות (assays) הניתנות להרחבה למחקר של הומיאוסטזיס חלבוני.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי הבחנה בין סיבי עמילואיד לבין מיני חלבונים מסיסים ומצטברים in vivo.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות קריאות כמותיות המבוססות על זמן חיים של פלואורסצנציה, המתואמות ישירות לרמות האגרגציה.
- ערך חזוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי מתן אפשרות להשוואת פיבריליזציה על רקעים גנטיים, גירויים סביבתיים או וריאנטים של עמילואיד.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקות המשך, על ידי אפשור מעקב אורכי ללא סימון (label-free) של אגרגציה של חלבונים בתאים ספציפיים כגון נוירונים.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה וסבירות לשחזור של הבדיקה, הודות לעצמאות של FLIM מרמות הביטוי של הפלואורופור ועמידותו להבהרה פוטוכימית (photobleaching).
- יכולת הרחבה: אפשור הערכה מהימנה של תרכובות על ידי זיהוי אסטרטגיות המעודדות או מונעות אגרגציה בכל מערכת ביולוגית התואמת למיקרוסקופיה של אור.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מקשר בין הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות ניטור דינמיקת אגרגציה לאורך תהליכי הזדקנות והפרעות ברשת הפרוטאוסטזיס במודלים רלוונטיים למחלה.
- החלטות מותאמות סיכון: תומך בהחלטות על קידום המחקר על ידי כימות של פראקציות חלבון מסיסות לעומת בלתי מסיסות באורגניזמים חיים לאורך זמן.
- הפחתת סיכון מכניסטית: מתמקד בערך ניבוי בעת חקר הומיאוסטזיס של חלבונים, ומאפשר השוואה של תעבורה והפצה של מיני חלבונים ללא צורך בצביעה נוספת.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
טכניקת FLIM משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד למחקרים פרה-קליניים, על ידי אספקת מדדים כמותיים ולא פולשניים של אגרגציה של חלבונים במערכות חיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבחינת השערות ובהבהרת מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה של מבני עמילואיד בתאים ספציפיים, כגון נוירונים, במהלך ההזדקנות.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה ותוצרים כמותיים באמצעות איסוף פוטונים והתאמת זמן חיים (lifetime fitting) המסירים פיקסלים עמומים ואותות רוויים לצורך מדידות אמינות.
- אנליזה: מספקת תוצאות סטטיסטיות, כגון ערכי chi-square קרובים לאחד וזמן חיים ממוצע משוקלל (tau one), להשוואה בין תנאים ולהערכת איכות ההתאמה.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לצפייה באגרגציה במודלים של הזדקנות ובמהלך הפרעה לרשת הפרוטאוסטזיס, דבר הרלוונטי למנגנונים של מחלות נוירודגנרטיביות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית להשוואת פיבריליזציה בין חלבוני עמילואיד שונים, רקעים גנטיים או גירויים סביבתיים in vivo.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי אגרגציה של חלבונים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של זיהוי עמילואיד in vivo ללא צביעה או הבהרה.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go, יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות זיהוי מוקדם של נטייה לאגרגציה.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על נתוני אגרגציה כמותיים ואורכיים במודלים רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדימוי זמן חיים של פלואורסצנציה (fluorescence lifetime imaging) ובפרוטוקולי בטיחות בלייזר.
- נדרשת מערכת מיקרוסקופיה בעלת יכולת FLIM עם עדשות מתאימות (למשל, 63X immersion) ויכולות גילוי פוטונים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים של פרמטרי רכישה כגון סנכרון סריקה (scan sync), קצב חזרות (repetition rate), gate max וספי פסיקה של איסוף פוטונים (10⁴–10⁵ ADC).
- כולל שיקולי התאמה בין מערכות מודל שונות, כולל הכנת פדי אגרוז, שימוש בחומרי הרדמה (למשל, sodium azide) ופרוטוקולי קיבוע.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בבדיקה מוקדמת של תכונות הפלואורופור במודל הנמטודה ומניעת הצטברות פוטונים (photon pileup) במהלך הרכישה.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:25
Synchronization of C. elegans and Mounting Nematodes onto Microscopy Slides
2:58
Acquisition of FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) Data
4:32
Analysis of FLIM Data Using FLIMfit Software
7:15
Results: Fluorescence Lifetimes
8:15
Conclusion
