מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

מכיוון ש-ATP הוא שליח תאי חשוב, פיתחנו שיטה המאפשרת לנו למדוד את קשירת ה-ATP לקולטנים שלו בדיוק גבוה. באמצעות FRET בין נגזרות נוקלאוטידים וחלבונים מתויגים פלואורסצנטית, אנו יכולים לעקוב אחר קשירת נוקלאוטידים לקולטנים פונקציונליים שלמים בזמן אמת וברזולוציה מרחבית מצוינת. אנו משתמשים בשיטה זו כדי להבין את ההשפעות של חילוף החומרים התאי על תעלת האשלגן הרגישה ל-ATP, אשר מעורבת בצורות מסוימות של סוכרת.

כדי לערוך ניסוי בממברנה ללא גגות, השתמשו תחילה בזוג מלקחיים כדי לשבור שבר קטן מחליק כיסוי עם תאים נגועים ושטפו את המקטע עם PBS. אם החלקת הכיסוי מצופה מראש בפוליליזין, הניחו את השבר בתחתית צלחת 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר PBS והחזיקו סוניק בדיקה של שלושה מילימטרים שלושה עד חמישה מילימטרים מעל הדגימה, פועם בעוצמה של 50 וואט ומשרעת של 20% עד 40% למשך 200 עד 500 אלפיות השנייה כדי לפתוח את גג התאים. אם החלקות הכיסוי אינן מצופות מראש, לאחר שטיפה עם PBS, טבלו את השבר בצינור המכיל 0.1% פולי-L-ליזין למשך כ-30 שניות לפני שתפרקו את קירוי התאים עם סוניקציה קצרה כפי שהודגם בהדגמה.

מעבירים את השבר הסוני לצלחת זכוכית מכוסה תחתית 35 מ"מ המכילה שני מיליליטר של תמיסת אמבטיה ומרכיבים את הצלחת על מיקרוסקופ הפוך המצויד ביעד טבילה במים בעל מפתח נומרי גבוה פי 60. בדקו שיציאת המצלמה של המיקרוסקופ מחוברת לספקטרוגרף בסדרות עם מצלמת CCD בעלת רגישות גבוהה והשתמשו במשאבה פריסטלטית כדי לחורר את תא האמבטיה עם חיץ בקצב זרימה של 0.5 עד מיליליטר חיץ לדקה. כדי לזהות שברי קרום לא מקורים המבטאים את התעלה המסומנת ANAP, עיין בדגימה כדי לאתר ממברנות עם תעלות פלואורסצנטיות.

הפעילו חלקית את מסיכת הספקטרומטר בין יציאת המצלמה במיקרוסקופ לבין הספקטרוגרף. צל המסכה יופיע על תמונת המצלמה. לרכוש שדה בהיר תמונה פלואורסצנטית של הממברנה unroofed כדי לאפשר בחירה של האזור של עניין לניתוח.

קרבו את קצה מערכת הזילוח למיקרו-נפח לקרום הלא מקורה. כדי לקבל תמונה של פלואורסצנטיות ANAP, לעורר את הממברנה עם LED 385 ננומטר דרך מסנן עירור מעבר פס 390/18 ננומטר ודיכרואית קצה 416 ננומטר, איסוף האור הנפלט דרך מסנן פליטה 400 ננומטר ארוך. הפעילו את מסיכת הספקטרומטר וודאו שהאור הנפלט עובר דרכה.

יישר את אזור העניין עם החריץ של מסיכת הספקטרומטר. הפעילו את גרגרי הספקטרומטר. עם הגרגרים במקומם, האור המפוזר על ידי הספקטרומטר יוקרן על השבב של מצלמת CCD כדי להפיק תמונות ספקטרליות.

התמונות ישמרו מידע מרחבי בממד Y. ממד X יוחלף באורך גל. תוך כדי התעסקות עם תמיסת חיץ ללא נוקלאוטידים, קבל חשיפה אחת או יותר של 0.1 עד עשר שניות לתיקון במורד הזרם ולנורמליזציה של הנתונים שנאספו לאורך שאר הניסוי.

לאחר מכן, יש למרוח טווח של ריכוזי TNP ATP בתמיסת אמבטיה כדי לקבוע עקומת תגובת ריכוז, תוך ערבוב כל תמיסה למשך דקה אחת לפחות כדי להבטיח הגעה למצב יציב ולקבל חשיפה לכל ריכוז. לאחר כל ריכוז, שטפו את TNP ATP בתמיסת אמבטיה נטולת נוקלאוטידים למשך דקה אחת לפחות לפני קבלת תמונת חשיפה לאחר הטיפול. כדי לבצע ניסוי פלואורומטריה מהדק טלאי, תחילה משוך פיפטות טלאי מנימי זכוכית בורוסיליקט עבים בעלי דופן להתנגדות של 1.5 עד 2.5 מגה-אוהם כאשר הם מלאים בתמיסת פיפטה.

לאחר מכן, להעביר כיסוי להחליק עם תאים נגועים לתוך צלחת זכוכית תחתית 35 מ"מ המכילה שני מיליליטר של תמיסת אמבטיה ולהרכיב את הצלחת על המיקרוסקופ ההפוך. יש לנקב את תא האמבטיה בתמיסת אמבטיה ולזהות תא המבטא תעלות מסומנות ANAP. הפעילו לחץ חיובי עדין על פיפטת טלאי והניחו את הפיפטה בתא אמבטיה.

לחץ על פיפטה כנגד קרום התא והחל יניקה עדינה כדי להשיג אטם ג'יגה-אוהם. כדי להסיר את המדבקה, הרחיקו במהירות את מחזיק פיפטה מהתא המתוקן. קרבו את קצה פיפטת המדבקה לקצה מערכת הזילוח, ובדקו שהמדבקה נמצאת בתוך החריץ של מסיכת הספקטרומטר.

לאחר מכן החל TNP ATP ואסוף ספקטרום תמונה. בתמונות אלה ניתן להבחין בשבר קרום טיפוסי ללא גג מתא HEK293T המבטא תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות בחלבון פלואורסצנטי כתום. בתמונה ספקטרלית זו של תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP בקרום לא מקורה מתא HEK293T שנחשף לחמישה מיקרו-טוחנים TNP ATP, ניתן לראות שני אזורים בעוצמה גבוהה המתאימים לשיא הפליטה של ANAP ו-TNP ATP.

ניתן לקבל ספקטרום סופי על ידי חיסור ספקטרום הרקע הממוצע מהאזור הממוצע של ספקטרום העניין. כאן, ניתן לראות את הירידה בפלואורסצנטיות שיא ANAP לאחר חשיפות מרובות. שיא הפלואורסצנטיות ממספר חשיפות בהיעדר TNP ATP הותאם לדעיכה מעריכית אחת.

נתונים אלה שימשו לאחר מכן לתיקון ממצאי פוטו-הלבנה. כאן מוצגות תמונות ספקטרליות מייצגות מקרום לא מקורה המתקבל מתא המבטא תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP בהיעדר ונוכחות TNP ATP. התבוננות בספקטרום הפליטה המתוקן מגלה הפרדה ברורה בין הפליטה הפלואורסצנטית של התורם למקבל.

באיור זה מוצגים זרמים מייצגים וספקטרום מתעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP מניסוי פלואורומטריה טיפוסי של מהדק טלאי. ספקטרום הפליטה מתוקן עבור רקע והלבנה כפי שהודגם עבור ממברנות ללא קירוי. היזהר עם פקדים כדי לוודא שהאות הפלואורסצנטי ספציפי לקולטן שלך.

ודאו שהשפע שלכם מהיר, יעיל ושלם ושמרו על חשיפות קצרות ככל האפשר. שיטה זו עונה על שאלות לגבי תפוסת קולטנים וכיצד היא קשורה לתפקוד. טכניקות FRET אחרות המשמשות עם מערך דומה יכולות לחקור שינויים אישור הנגרמים על ידי ליגנד בקולטן.