חלבון ניטור ספיחה עם מצב מוצק nanopores

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור ננו-נקבים בממברנות מלאכותיות לשימוש במחקרי ספיגת חלבונים. דבר זה מושג על ידי קידוח ננו-נקבים בממברנת ניטריד באמצעות STEM. לאחר מכן, הננו-נקב נטען לתוך תא ומוסמך בתמיסה יונית.

כך הנוזל יוצר גשר מצד אחד של הננופור לצדו השני כדי להכין את הננופור לניסויים. מופעל עליו מתח חשמלי וניתן להבחין בזרם של יונים העובר דרכו. השלב האחרון הוא הוספת חלבון לתא הננופור.

בסופו של דבר, תצפית על חסימות ארוכות טווח בזרם היוני לאורך הננונקור חושפת ספיחה של חלבונים לדפנות הננונקור. שלום, אני דייב ויקי. אני סטודנט לתואר מתקדמים במחלקה לפיזיקה באוניברסיטת סיראקיューズ.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ספיגה של חלבונים על פני שטח אנאורגניים, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות כגון אינטראקציות בין חלבונים לחומצות גרעיניות, ספקטרוסקופיה של מולקולה בודדת, וחקר של מולקולות במרחבים מוגבלים. התחלו בהעלאת הגבעול למתח האצה.

בשלב הבא, טענו רשת חלון מסיליקון ניטריד של SPI לתוך מחזיק הדגימות של ה-TEM. נקו את הרשת באמצעות פלזמה של חמצן למשך 30 שניות כדי להסיר שאריות. לפני טעינת הדגימה, הכניסו את מחזיק הדגימות ל-TEM והמתינו עד להשגת ואקום.

באמצעות מצב TEM בשדה בהיר (brightfield), אתרו את חלון הניטריד, המופיע כריבוע בהיר בתוכנה הגולמית. ודאו שה-TEM מיושר כראוי. לאחר מכן, יישרו ומקדו את הדגימה.

כעת העבירו את המערכת למצב STEM והשתמשו בגלאי hot off כדי לדגם את הדגימה ולבדוק את היישור שלה. הגדירו את המונוכרומטור, אם קיים, לערך נמוך, כדי לאפשר זרם גבוה יותר של אלקטרונים הזמינים לקידוח. בחרו את גודל הנקודה המתאים לקידוח הננו-נקב (Nanopore) בהתבסס על קוטר הגשש האלקטרוני.

כאשר הגבעול מיושר, השתמש ב-BROGRAM כדי לבצע מיקוד מדויק של ממברנת הניטריד בהגדלה הנדרשת. אם קיימת תנועה כלשהי של הדגימה, בצע blank לקרן האלקטרונים והמת להתייצבות הדגימה.

תהליך זה עשוי להימשך עד שעה. לאחר הייצוב, מקמו את קרן האלקטרונים על הדגימה והתחילו בקידוח הננו-נקב. קידוח ננו-נקב באמצעות TM דורש סבלנות רבה.

זהו תהליך שבו ניטריד מתפזר בהדרגה תחת קרן אלקטרונים. חשוב לשמור על קרן האלקטרונים ישירות מעל אתר הקידוח ולוודא שהננו-נקב נקדח לחלוטין. לפני הוצאת הדגימה מה-TEM, יש לבדוק את הדגימה מדי פעם באמצעות סריקה עם גלאי ה-hot off.

אם הדגימה נסחפת מעט, התאימו את מיקום קרן האלקטרונים כך שתהיה מעל הננו-נקב. כאשר ה-ROI gram נמצא בפוקוס, סרט הניטריד המנצנץ ייעלם. כאשר הננו-נקב נוצר וה-roky gram אינו בפוקוס, ניתן להבחין בשולי ה-fray nail.

צלם את הננופור כאשר החימום כבוי וצור פרופיל עוצמה של התמונה. ניתן להעריך את קוטרו של הננופור לפי האזור הכהה ביותר בפרופיל. ניתן להשתמש בקרן האלקטרונים כדי להרחיב את הננופור במידת הצורך.

כאשר הגיע לקוטר הנדרש, העבירו למצב TEM עם המונוכרומטור בהגדרה הסטנדרטית. השתמשו ב-TEM בשדה בהיר כדי לאשר את גודל הנקבובית.

התחילו בהכנת תמיסת סלין מנוונת. הניחו את התמיסה תחת ואקום ובמכשיר סוניקציה למשך 20 דקות. בזהירות, הניחו את שבב הסיליקון ניטריד השביר המכיל ננו-נקב (Nanopore) לתוך כלי ביקר פיירקס של 10 מיליליטר. לאחר מכן, בתוך מנדף, הניחו את הכלי על פלטה מחממת.

נקה בזהירות רבה את שבב ה-Nanopore באמצעות תמיסת פיראנה. ראשית, הוסף שלושה מיליליטר sulfuric acid למכל באמצעות פיפטת זכוכית. שנית, הוסף בזהירות מיליליטר אחד של hydrogen peroxide בריכוז גבוה ל-sulfuric acid.

יש לנקוט בכל אמצעי הזהירות. יש להשרות את שבב הננו-נקב (nanopore chip) למשך 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות פיפטת זכוכית, יש להוציא את תמיסת הפיראנה (piranha solution) מהכלי ולהשליכה באופן בטוח.

בשלב הבא, מלאו את הכוס עם מים דה-יוניים שעברו נידוף גזים (Degas). בעזרת פיפטת זכוכית נקייה, רוקנו את המים מהכוס וחזרו על פעולת השטיפה הזו לפחות חמש פעמים. בעזרת פינצטה נקייה, הוציאו את שבב הננו-נקבים וייבשו אותו באמצעות שאיבה קלה.

לאחר הייבוש, אטמו מיד את שבב הננו-נקב (nanopore chip) בתוך התא. ניתן לקבע את השבב בתא באמצעות טבעות O-ring או איטום סיליקון. מלאו את התא בתמיסת פוטסיום כלוריד.

חברו את אלקטרודות הכסף וכסף-כלוריד לתא. ניתן להכין את האלקטרודות על ידי השריה של חוט כסף במלבין למשך לילה. הפעילו פוטנציאל טרנס-ממברנלי על פני האלקטרודות ועקבו אחר תגובת הזרם באמצעות מגבר patch clamp.

במצב קיבוע מתח (voltage clamp), בנה עקומת זרם-מתח מהמדידות. העקומה צריכה להיות ליניארית מאוד. כאשר משתמשים בבסודיום כלוריד בריכוז של 1 M, המוליכות של הננונקב צריכה להתאים לקוטרו.

אם הננו-נקב אינו מציג עקומת IV ליניארית, המוליכות נמוכה מדי או שזרם הפתיחה של הננו-נקב אינו יציב. דבר זה מעיד על כך שהננו-נקב אינו מחובר כראוי ויש לחזור על השטיפה. חשוב לוודא כי נוזל נמצא בתוך הננו-נקב.

אם שלב זה לא יבוצע כראוי, זרם היונים דרך הננופור יציג רעש גבוה מאוד והחלקרה של חלבונים אל תוך הננופור תפחת באופן דרסטי. התחל בהוספת דגימה מנוקה של החלבון המדובר אל תוך האמבט המוארק של התא. המתן עד שהדגימה תתפשט באופן מלא.

הפעל מתח פוטנציאל טרנס-ממברנלי עם קוטביות הפוכה לזו של המטען הכולל של החלבון הנחקר. פוטנציאל מופעל של 200 millivolts אמור להיות מספיק כדי לאפשר תצפית. מרבית האירועים של האנליטים החלבוניים יופיעו כסטיות זרם חולפות מקו הבסיס.

אם לא נצפה אות, הגבירו את ריכוז החלבון בתא. מתחים גבוהים יותר משפרים את יחס האות לרעש ואת הניטריד. ננונקבבים יכולים לעמוד בכמה וולטים.

ספיחות חלבונים יופיעו כשינויים ארוכי-טווח בזרם הבסיס של הננופור. תוצאות טיפוסיות עבור ננופורים במצב מוצק יהיו כדלקמן. זרם הפור הפתוח אמור להיות יציב מאוד.

מאפייני ה-IV של הננונקב צריכים להיות ליניאריים מאוד. ב-one molar potassium chloride, 10 molar potassium phosphate pH 7.4, השיפוע של התאמה ליניארית לעקומת ה-IV יספק את המוליכות היחידה של הננונקב. למוליכות יש קשר ישיר לקוטר הננונקב והיא צריכה להתאים למשוואה.

ערך זה צריך להיות תואם בטווח של 30%. אם הערך קטן מדי, סביר שהנקב אינו מצומד עם הוספת חלבון. אירועים מהירים צריכים להתרחש; ספיגת חלבון היא ירידה ממושכת בזרם. חלק מהחלבונים הם לביליים מאוד ועוברים שינוי מבני בתוך פנים הנקב.

במקרה זה, מפל המתח ארוך הטווח ילווה בתנודות מהירות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיירו הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים ננו-נקבים במצב מוצק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר עם סריקה (STEM), וכיצד להשתמש בהם לספיחת חלבון SA. אל תשכחו כי עבודה עם תמיסת פיראנה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון עבודה במנדף עם כפפות, חלוק מעבדה וסינר כימי בעת ביצוע הליך זה.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.