שכפול של מבנה משטח שורש באמצעות שינוי של ליתוגרפיה רכה
5 באוגוסט 2020
ביואימטיקה שימש בעבר ככלי לחקר אינטראקציות העלה-מיקרואורגניזם. עם זאת, לא קיים כלי כזה עבור שורשים. כאן, אנו מפתחים פרוטוקול כדי ליצור משטחים סינתטיים מחקה מיקרומבנה שורש פני השטח לחקר אינטראקציות סביבה שורש.
פרוטוקול זה מאפשר לפתח מערכת סינתטית המחקה את מיקרו-מבנה פני השורש. המערכת יכולה לשמש לחקר אינטראקציות סביבית השורש באופן בקרה עם דגש על מבנה פני השטח. זוהי טכניקה פשוטה שניתן לבצע בכל מעבדה לומדת אינטראקציות סביבה שורש.
בנוסף, טכניקה זו מאפשרת היווצרות של פני השטח מחומרים שונים. הצעד הקשה ביותר הוא הסרת השורש הטבעי מהתבנית השלילית. שלב זה דורש טיפול עדין של השורש, כדי למנוע קריעת שערות השורש.
הדגמה חזותית תשפר את יכולתו של הצופה לשכפל הליך זה. התחל על ידי הסרת הצמח מהאדמה לאחר שלושה שבועות של צמיחה. חותכים את מערכת השורש מהצמח בנקודת האינטראקציה עם הגבעול ומכניסים את הצמח חסר השורשים לתוך מקור עם מים.
לאחר מספר ימים, חותכים את השורשים ההרפתקניים העולים מהגזע ומשתמשים בהם לשכפול. כדי להכין שורשים נבטים זרעים, להרטיב נייר מסנן בתוך צלחת פטרי עם מים ולשים כמה זרעי M82 על הנייר. הדגירה את המנה ב 25 מעלות צלזיוס לחות את הנייר כל יום.
כחמישה ימים לאחר מכן, השורשים הנביטה יהיו ארוכים מספיק כדי להשתמש בהם לשכפול. הכן פתרון עותק משוכפל שלילי על ידי הוספת 9.49 גרם של דימתרילט diurethane ל 50 מיליליטר. מוסיפים 1.45 מיליליטר של אתיל מתאקרילאט לגביע ומאחסנים בטמפרטורת החדר עד שהפתרון הופך הומוגני ונראה ברור.
מוסיפים שלושה מיליליטר של הפלסטיק ומערבבים את הפתרון לשעה נוספת. לאחר מכן מוסיפים 300 מיקרוליטרים של יוזם התמונות ומערבבים בן לילה או עד שכל הבועות מוסרות. כדי ליצור את העותק המשוכפל השלילי של השורש, קח שקופית זכוכית נקייה ושפוך מיליליטר אחד של פתרון העותק המשוכפל השלילי עליו.
מניחים שניים עד שלושה שורשים על הפתרון, מוודאים שהשורשים אינם מכוסים במלואם. שמור את השקופית תחת מנורה אולטרה סגולה שמונה ואט במשך שמונה עד 10 דקות, ולאחר מכן לכבות את מנורת UV. הסר את העותק המשוכפל ממגלשת הזכוכית והניח אותו בצלחת פטרי מלאה באתנול כדי להסיר מונומר לא מוקט.
השתמש במדפים כדי להסיר באיטיות ובעדינות את השורש מהעותק המשוכפל. כדי להכין את פתרון PDMS עבור העותק המשוכפל החיובי, מניחים 10 גרם של דימתיל סילוקסאן ב. מוסיפים גרם אחד של סוכן ריפוי ומערבבים היטב.
מחממים את התערובת ב desiccator תחת ואקום במשך שעתיים כדי להסיר בועות אוויר. מניחים את העותק המשוכפל השלילי פוליאוריתן בצלחת פטרי ויוצקים את תערובת PDMS על גבי העותק המשוכפל השלילי. החל ואקום במשך שעתיים כדי להבטיח כיסוי של המיקרו-מבנה ולשמור את צלחת פטרי בטמפרטורת החדר לילה.
ביום שלמחר, הפרד את העותק המשוכפל החיובי נרפא מהעותק המשוכפל השלילי באמצעות מדפים. כדי להכין את העותק המשוכפל החיובי מתאית אתיל, להוסיף 20 מיליליטר של אתנול ל 100 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 1.32 מיליליטר של plasticizer ו 3.3 גרם של תאית אתיל.
ומערבבים את הפתרון בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. ביום שלמחרת, יוצקים את פתרון תאית אתיל על גבי העתק שלילי בצלחת פטרי ולהשאיר את המנה מתחת למכסה המנוע לילה. לאחר מכן הסר באיטיות את העותק המשוכפל החיובי מהעותק המשוכפל השלילי עם מדפים.
ניתן ליצור עותק משוכפל שלילי טוב אם הפרוטוקול פועל כראוי. העתק זה יראה את מבנה התא של פני השטח של השורש, כמו גם חורים המייצגים את המיקום של שערות השורש. אם השורש שקוע בתתבת הפוליאוריטן, הוא ייפול בפולימר הקשה וישאר בתוך העותק המשוכפל השלילי לאחר שנרפא.
בעת ריפוי עם אור UV, העולה על זמן הריפוי המומלץ, יגרום עובש פוליאוריתן קשה מאוד, מה שהופך אותו בלתי אפשרי להסיר את השורש מבלי לשבור אותו. לפעמים חתיכות השורש הן כל כך קטנות כי מיקרוסקופיה נדרשת כדי לראות אותם. עותקים משוכפלים חיוביים נוצרו באמצעות PDMS ואתיל תאית.
שערות השורש נמצאות באזור התארכות שבו הן מתחילות לצוץ. אורכיהם משתנים לאורך משטח השורש ככל שהם מתארכים, בדומה לשורש הטבעי. חלק מהשיערות על העתק תאית אתיל נראים אפילו מתחת למיקרוסקופ האור.
בעת הצבת השורש מעל פתרון העותק המשוכפל השלילי, חשוב לבחור את הצד הימני ולהימנע מטביעת השורש בתוך הפתרון. טכניקה זו פותחה כדי לספק שדרה חדשה לחקר אינטראקציות סביבה משטח השורש. באופן ספציפי, הכוחות הפיזיים הנגרמים על ידי מיקרו מבנה ומאפיינים חומריים של פני השטח.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר פיתוח של משטחים סינתטיים המדמים את המיקרו-מבנה של פני השורש, ובכך הוא מקל על ביצוע מחקרים מבוקרים של אינטראקציות בין השורש לסביבתו. הטכניקה פשוטה וניתן לבצעה בכל מעבדה המתמקדת במחקרי שורשים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביומימטיקה
- ביולוגיה של צמחים
- מיקרו-מבנה של שורשים
רקע
- מחקרים קודמים עשו שימוש בביומימטיקה עבור אינטראקציות בין עלים למיקרואורגניזמים.
- לא היו זמינים כלים קיימים לחקר אינטראקציות של שורשים.
- מחקר זה נותן מענה לפער זה על ידי יצירת משטחי שורשים סינתטיים.
- הפרוטוקול מדגיש את חשיבות מבנה המשטח במחקרי שורשים וסביבה.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת סינתטית המדמה את המיקרו-מבנה של פני השורש.
- מתן אפשרות למחקרים מבוקרים של אינטראקציות בין השורש לסביבה.
- אספקת טכניקה הניתנת לשחזור עבור חוקרים בביולוגיה של צמחים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאת שורשים מצמחים והכנת תבניות שליליות.
- שימוש ב-diurethane dimethacrylate וב-ethyl methacrylate ליצירת העתקים שליליים.
- הכנת העתקים חיוביים באמצעות PDMS ו-ethyl cellulose.
- הדגמות חזותיות לסיוע בשחזור הפרוצדורה.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של רפליקות שליליות וחיוביות של משטחי שורשים.
- הרפליקות מייצגות באופן מדויק את מבנה התאים ואת מיקומי שערות השורש.
- הוכחת ההיתכנות של שימוש בחומרים שונים עבור רפליקציה של המשטח.
- מתן תובנות לגבי הכוחות הפיזיקליים המשפיעים על אינטראקציות בין השורש לסביבתו.
מסקנות
- טכניקה זו פותחת נתיבים חדשים למחקר באינטראקציות של פני השורש.
- היא מאפשרת מחקרים מפורטים על השפעות המיקרו-מבנה על התנהגות השורש.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על פרוטוקול זה כדי לבחון גורמים סביבתיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמה ביומימטית זו מאפשרת חקירה מבוקרת של השפעות מיקרו-מבנה פני השורש על אינטראקציות מיקרוביאליות, ובכך נותנת מענה לפער קריטי במחקר על יחסי גומלין בין צמחים למיקרובים. באמצעות שחזור של ארכיטקטורות עדינות של שערות שורש בחומרים סינתטיים, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכנית של היפותזות הנוגעות לתהליכים ביולוגיים המתווכים על ידי פני השטח. גישה זו מספקת מערכת ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר להערכת האופן שבו מאפיינים פיזיים של פני השטח משפיעים על התנחלות מיקרוביאלית והפרשת אנזימים בתהליכי גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של קשרי מבנה-תפקוד באינטראקציות בין שורשים למיקרובים על ידי בידוד הטופוגרפיה של הפני השטח כמשתנה בלתי תלוי.
- ערך תפעולי: מספק משטחים סינתטיים הניתנים לשחזור לצורך בדיקה עקבית של היפותזות לאורך חזרות ניסיוניות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר תבניות מיקרו-מבניות מדידות להערכה סטנדרטית של היצמדות מיקרובית ופעילות אנזימטית.
- ערך תפעולי: תומך בגמישות בחומרים (PDMS, ethyl cellulose) להתאמת תכונות השטח למטרות סריקה ספציפיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר מעקב אחר מיקום מיקרואורגניזמים ביחס למאפייני שטח מוגדרים, ובכך מאפשר קורלציה בין המיקרו-מבנה לבין פלטים תפקודיים כגון הפרשת cellulase.
- ערך תפעולי: מספק אפשרות לשימוש ב-ethyl cellulose בעל יכולת התפרקות, לצורך מידול שינויים דינמיים של פני השטח במחקרי אתגר מיקרוביאליים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה ממוקמת בשלב הביולוגיה של הגילוי, ומאפשרת יצירת היפותזות לגבי התנהגויות מיקרוביאליות המתווכות על ידי פני השטח, בטרם ביצוע סריקת תרכובות או מאמצים לאופטימיזציה של מולקולות מובילות (lead optimization).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי מתן אפשרות לשינוי שיטתי של צפיפות שערות השורש ומאפייני אזור ההארכה, כדי לבחון את השפעתם על התנהגות מיקרובית.
- סריקה: מייצר משטחים סטנדרטיים הניתנים לשחזור לצורך הערכה בעלת נאמנות גבוהה של אינטראקציות מיקרוביות תחת תנאי שטח מבוקרים.
- אנליטיקה: מאפשר מיפוי מרחבי של מיקום המיקרואורגניזם ביחס למיקרו-מבנה המשטח, ומספק תוצרי קריאה כמותיים מבוססי דימיוג למחקרי אינטראקציה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ניתוח מיקרו-מבנה בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות משטחים ביו-מימטיים המשקפים את ארכיטקטורת השורש הטבעית.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן טכנולוגיית פלטפורמה ישימה על פני מיני צמחים ומערכות מיקרוביאליות מרובים, ובכך מפחית פיתוח דגמים כפולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי שורש-מיקרובה על ידי הפרדת מבנה הפני השטח ממשתנים כימיים וביולוגיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולי יציקה ושחזור סטנדרטיים התואמים לציוד מעבדה סטנדרטי.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות מסוג go/no-go באמצעות אספקת מודלים חיזויים של פני השטח, המפחיתים את ההסתמכות על דגימות טבעיות משתנות.
- השפעה על פורטפוליו המחקר: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של יעדי מיקרובה או תרכובות, בהתבסס על פרופילי אינטראקציה התלויים במבנה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות צמחים ובטכניקות ליטוגרפיה רכה ליצירת תבנית מוצלחת.
- דורש ציוד להקשחה ב-UV ודסיקטור ואקום להפקת העתקים נטולי בועות.
- דורש פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת שורשים כדי להבטיח לכידה עקבית של המבנה המיקרוסקופי בין סדרות שונות.
- כולל פשרות בבחירת חומרים בין עמידות של PDMS לבין התפרקות ביולוגית של ethyl cellulose, בהתאם למטרות המחקר הספציפיות.
- מוגבל על ידי הצורך בחילוץ עדין של השורש כדי לשמר מבני שערות עדינים במהלך יצירת תבנית השלילה.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Root Preparation
1:37
Preparation of the Root Negative Replica from Polyurethane
2:47
Preparation of the Root Positive Replica from PDMS and Ethyl Cellulose
4:05
Results: Microscopy Images of Negative and Positive Replica
5:14
Conclusion
