הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

פרוטוקול זה מספק פלטפורמת תרבות תאים שבה ניתן לשלוט במדויק במאפיינים של מטריצה חוץ-תאית כגון נוקשות, הרכב חלבונים ומורפולוגיה של תאים באופן חסכוני וחסכוני. השיטה חסכונית, אינה דורשת הכשרה או מתקנים מיוחדים. הוא תואם גם לשיטות כימות תאיות מרובות כגון כתמים immunofluorescent וכתם מערבי.

טכניקה זו מספקת הבנה מכנית של ביולוגיה של התא שוואן. עם תובנה נוספת על עיצוב ביו-חומרי להתחדשות מערכת העצבים, ניתן להחיל אותו על כל תא תלוי עגן. החלק המאתגר ביותר בפרוטוקול זה הוא הדפסת מיקרו-קרטקט.

לפני תחילת הפרוטוקול, הדפסת מיקרו-קונקט על מצע באמצעות פלורסנט כדי לתייג את החלבון כדי לאמת חזותית את ההדפסה הסופית לתבנית. התחל על ידי ערבוב נמרץ אלסטומר בסיס PDMS וסוכני ריפוי עם קצה פיפטה עד בועות מפוזרים הומוגנית בתוך התערובת. לאחר מכן להסיר את הבועות עם ייעוד ואקום.

מניחים טיפה של תערובת PDMS מיובשת על כיסוי מרובע או עגול, ולסובב את כיסוי על מעיל ספין ב 2, 500 סל"ד במשך 30 שניות. הדגירה את הכיסויים בתנור ב 60 מעלות צלזיוס, במשך שעה עד שעתיים, או בטמפרטורת החדר לילה. כדי להכין מצע בדוגמת מיקרו, מניחים רקיק סיליקון בדוגמת בתוך קוטר מעגלי 150 מילימטר על ידי 15 מילימטר גובה צלחת פטרי ויוצקים PDMS de-gassed על הוופל.

ביסס את ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות במהלך הלילה. אפשר ל-PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש אזמל כירורגי לחתוך בולים של 30 על ידי 30 מילימטר ריבועים המכילים את הדפוסים הנכונים דואג לא לפגוע רקיק הסיליקון.

יש לטשטש את חותמות ה-PDMS ואת תלושי הכיסוי הניתנים לכוונון על-ידי טבילתם ב-70%אתנול למשך 30 דקות. כדי לאשר את היעילות של המיקרופטרן, ייבש את פני השטח של חותמות PDMS באמצעות זרם אוויר מסונן ופתרון פיפטה 15 מיקרוגרם למיליליטר BSA כדי לכסות את כל הצד בדוגמת החותמת. הדגירה את הבולים עם פתרון BSA במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר סחת חלבון, ולאחר מכן אוויר לייבש את הבולים כדי להסיר את פתרון BSA.

השתמש בזרם האוויר המסונן כדי לייבש את פני השטח של תלושי הכיסוי הניתנים לכוונון. הביאו את הצד בדוגמת החותמת למגע קונפורמי עם הכיסוי הניתן לכוונון כדי לאפשר סגיפה של BSA על משטח הכיסוי, ולחץ בעדינות על החותמת כנגד הכיסוי במשך חמש דקות. בדוק את המיקרופטרן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן FITC.

כדי להדפיס אזורי דבק של תאים במקום תבניות פלואורסצנטיות, יש להחליף למינין בחלבון BSA. מוציאים את הבולים מתלי הכיסוי ומעבירים את מחליקי הכיסוי לצלחת מעקרת של שש בארות. הוסיפו שני מיליליטר של תוסף F-127 פלואורוני 0.2% לכל באר כדי לכסות את פני השטח של תלוש הכיסוי ולהדגיר את הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר.

שאפו את פתרון ה-F-127 ושטפו את החלקות הכיסוי חמש פעמים עם PBS, פעם אחת עם מדיום תרבות התאים, ואז זרעו את תאי שוואן בצפיפות זריעה של 1000 תאים בריבוע של 1000 תאים. 45 דקות לאחר זריעת התא, להסיר את מדיום תרבות התא ולשטוף את הכיסוי מחליק פעמיים עם PBS כדי למנוע תאים מרובים לבקיע לאותה תבנית. שמור על תאים בסביבת תרבות התאים הרצויה במשך 48 שעות לפני הכימות.

ליצירת מצעים של תרבות תאים בדוגמת קו לבחינת תאים מיושרים, הכינו את הבולים לפי כיווני כתב היד וחתכו אותם לממדים הרצויים. הכינו שתי מנות פטרי מצופות משטח PDMS ניתן לכוונון כפי שתואר קודם לכן, ובצעו הדפסת מיקרו-פונטקט להדפסת אזורי דבק תאים בדוגמת קו על אחת המנות. לאחר הסרת הבולים, מלאו את צלחת פטרי בארבעה מיליליטר של 0.2% פתרון F-127 פלורון והדגירה במשך שעה.

שוטפים כל צד של חותמת PDMS שלוש פעמים עם 70% אתנול ומייבשים אותו באוויר. סובב את חותמות ה- PDMS והדפס את אזור דבק התא הלא מרוסן בצלחת פטרי השנייה כמתואר לעיל. לאחר הדגירה את הכלים עם פתרון F-127, להסיר את הפתרון ולשטוף את הכלים שלוש פעמים עם PBS ופעם אחת עם מדיום תרבות תאים טריים.

לאחר מכן זרעים תאים על הכלים, ולשמור אותם בתנאים הרצויים במשך 48 שעות לפני הכנת lysates. כדי להכין ליזאטים, לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח במשך שתי דקות, ולאחר מכן להוסיף 80 microliters של פתרון RIPA, מוכן על פי הוראות כתב היד, על כל אזור דבק התא, ו דגירה התאים על גוש קרח במשך 25 דקות. לגרד את התאים Schwann עם מגרד התא במשך חמש דקות ולאסוף את lysate לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה שכותרתו 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה ליאזט במשך 15 דקות ב 12 אלפים G וארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור מיקרוצנטריפוג נקי. מצעים מצופים למינין גרמו לקצב התפשטות גבוה יותר בהשוואה למצעים מצופים קולגן ופיברונצין.

תאי שוואן על מצעים עם ציפוי למין ומודולי שונה הראו כי מצעים רכים יחסית הפחיתו את שיעורי התפשטות התאים. התאים נותחו גם לביטוי חלבון. ביטוי גורם שעתוק c-יוני היה מוסדר כמו מצעים הפכו רכים יותר.

עם זאת, זה היה מוסדר באופן משמעותי על המצע הרך ביותר. על מצעים נוקשים, מצעים מצופים קולגן הביאו לביטוי c-Jun הגבוה ביותר, כמו מצעים הפכו רכים יותר, למינין הראה את הרמות הגבוהות ביותר של c-יוני. התאים היו מוכתמים אז ברודאמין-פאלודין כדי לחקור את תפקיד התפשטות התאים ואת האזור בביטוי c-Jun.

כאשר נוצרו קווי דבק תאים על מצעי תרבות התאים, יחס הגובה-רוחב הגרעיני של תאים הנזרעים על מצע התבנית גדל בהשוואה לזה של תאים על מצעים לא מגולפים. ביטוי של קולטן נוירוטרופין c-יוני ו p75 היו מוסדר בתאים צפופים עם אזור התפשטות קטן יותר. תאים בעלי תבנית קו גרמו גם לביטוי גבוה יותר הן של c-Jun והן של p75 NTR בהשוואה לתאים שאינם בעלי תבנית.

גיאומטריות דבק תא מודפס Microcontact נוצרו כדי לשלוט במדויק באזור הפצת תאים והתאונה תוך ביטול אינטראקציות בין תאים לתאים. הגדלת יחס הגובה-רוחב התאי גרמה להגדלת התארכות גרעינית. הביטוי של c-Jun היה מוסדר הן על ידי התארכות הסלולר והן על ידי עיכוב הפצת תאים.

כתמי שפעת חיסונית הן עבור גרעינים והן עבור actin אישרו כי אזור התפשטות התא וההת התא נשלטו במדויק באמצעות שיטת micropatterning זו. טכניקה זו סללה דרך להשתמש במצעים הניתנים לכוונון שלנו כשיטה לנתח באופן מכני את ביולוגיית התאים של שוואן ואת האיתות בהקשר של התחדשות וסרטן.