ב Vivo CRISPR / Cas9 הקרנה בו זמנית להעריך תפקוד גנים בעור העכבר וחלל הפה
2 בנובמבר 2020
כאן אנו מתארים מתודולוגיית הקרנה מהירה וישירה vivo CRISPR /Cas9 באמצעות אולטרסאונד מונחה זריקות lentiviral עוברי הרחם כדי להעריך בו זמנית פונקציות של מספר גנים בעור וחלל הפה של עכברים immunocompetent.
פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לחוקרים לחקור בו זמנית את הפונקציות המדכאות את הגידול של מאות גנים בסרטן הראש והצוואר בשבריר מהעלות של מודל עכבר נוקאאוט קונבנציונלי. טכניקה זו גמישה וניתן להתאים אותה לכיסוי ביטוי גנים כדי לחקור את תפקודם בעור. ניתן ליישם את פרוטוקול ספריית הקריספר הממוקד גם עבור סוגי סרטן אחרים.
הנח את הצד הגחוני של בעל החיים המורדם כלפי מעלה על שלב הניתוח המחומם והשתמש בסרט כירורגי כדי להחזיק את הכפות במקומן. יש למרוח את צינור ההרדמה של האף לאספקה קבועה של איזופלורן וחמצן עד לסיום הניתוח. כדי לאשר הריון E9.5, מרחי כמות קטנה של קרם להסרת שיער על הבטן ומרחי אותו על שטח של שלושה על שלושה סנטימטרים רבועים באמצעות אפליקטור עם קצה כותנה.
לאחר שתיים-שלוש דקות, הסר בעדינות את הקרם עם גזה או טישו ונגב את האזור באמצעות PBS ואתנול 70%. בעזרת בדיקת האולטרסאונד והג'ל, בדוק את העכבר ההרה ליום E9.5 העוברי. ניתן לעשות זאת גם יום קודם ב-E8.5 כדי לחסוך זמן ביום הניתוח.
הסר את ג'ל האולטרסאונד ונגב את האזור באמצעות BPS ולאחר מכן 70% אתנול. להזריק הכי הרבה עם משכך כאבים תת עורי. לאחר מכן אתה מלקחיים ומספריים סטריליים כדי לבצע חתך אנכי בעור.
השתמש במלקחיים קהים כדי להפריד את העור סביב החתך מהצפק. לאחר מכן אתה מלקחיים ומספריים סטריליים כדי לחתוך את הצפק. בעזרת מלקחיים קהים, משוך בעדינות את קרן הרחם השמאלית והימנית וספור את העוברים.
הכנס מחדש את רוב קרני הרחם, אך השאר את הקצה הדיסטלי של קרן רחם אחת המכילה שלושה עוברים חשופים. בעזרת מלקחיים קהים, דחפו ומשכו בעדינות את הרחם עם שלושת העוברים, דרך הפתח בקרום הסיליקון של צלחת הפטרי ששונה. מייצבים את צלחת הפטרי באמצעות קוביות חימר דוגמנות.
ייצב את הרחם עם שלושת העוברים בתוך צלחת הפטרי, באמצעות תבנית סיליקון. לאחר מכן משטחים את פקק הסיליקון בצד העוברים בעזרת כלי קהה. מלאו את צלחת הפטרי ב-PBS סטרילי ושטפו את קרום הסיליקון בתחתית צלחת הפטרי, עם בטן הסכר ההרה, ובכך מונעים כל דליפה.
העבירו את ראש האולטרסאונד לצלחת הפטרי, כ-0.5 סנטימטרים מעל העובר העליון והתאימו את השלב כך שחלל מי השפיר ייראה בבירור בתצוגת האולטרסאונד. יישר את מחט המזרק, בזהירות לתוך צלחת הפטרי ששונה. בעזרת המיקרומניפולטור, הנח את קצה המחט בטווח של חמישה מילימטרים מהעובר העליון, ולאחר מכן סובב את המחט קדימה ואחורה כדי לנוע למישור שבו קצהו נראה הבהיר ביותר בתמונת האולטרסאונד.
בעזרת המיקרומניפולטור, דחף את המחט דרך דופן הרחם לתוך חלל מי השפיר. הזרקו 62 ננוליטר של ה-lentivirus עם ספריית sgRNA במהירות הזרקה איטית. לחץ על כפתור ההזרקה שמונה פעמים ובסך הכל 496 ננוליטר לעובר.
חזור על אותו הליך עבור שני העוברים האחרים. לאחר מכן הרם את ראש האולטרסאונד והסר את פקק הסיליקון. דחף בעדינות את שני העוברים הראשונים מתוך שלושת העוברים לתוך בטן העכבר באמצעות צמר גפן סטרילי.
משוך את שלושת העוברים הבאים ודחף פנימה את העובר השלישי שהוזרק קודם לכן. חזור על הליך ההזרקה עד להזרקת מספר העוברים הרצוי, והקפד לא לחרוג מ-30 דקות הרדמה. בסיום, הרם את ראש האולטרסאונד, הסר את המיקרומניפולטור בעזרת המחט, שאב את ה-PBS והסר את צלחת הפטרי.
בעזרת מגבונים סטריליים, ספגו את כל PBS שאולי הצטבר בחלל הבטן. סגור את חתך הצפק באמצעות תפרים נספגים. לאחר מכן השתמש בשני סיכות כדי לסגור את החתך בעור הבטן.
לאחר מכן, קריאות ריצוף דור של DNA מוגבר PCR מתאים מותמרים ספריית פלסמיד ולנטי-ויראלי אמורות להראות מתאם גבוה. אם קריאות ה-sgRNA מ-DNA פלסמיד אינן מציגות ייצוג שווה של sgRNAs, יש לחזור על הליך ההכנה והריכוז הנגיפי בזהירות. התוצאות של הזרקה מונחית אולטרסאונד של לנטי-וירוס הנושא Cre recombinase בגורי עכברי קונפטי E9.5 Lox-STOP-Lox ביום שלאחר הלידה P0, מוצגות כאן.
בעוד שטיטר גבוה של הנגיף יביא לכיסוי גדול יותר של עור העכבר, זה גם יביא להתמרה של מספר sgRNAs לאותו תא. תרשים זה מציג קריאות ריצוף מהדור הבא של DNA מוגבר PCR, מתאים מותמרים בספריית פלסמיד ולנטי-ויראלי, כמו גם קריאות מארבעה גידולים מייצגים. מדריכי sgRNA המכוונים למדכאי גידול ADAM10 ו-RIPK4 מועשרים בדגימות הגידול בהשוואה למאגר הפלסמיד או לתאים נגועים.
ביצוע הניתוח ב-E9.5 הוא קריטי. זכור לבדוק הריון באמצעות אולטרסאונד, תשעה ימים לאחר התקנת הצלב ולזהות את נקודת הזמן העוברית בכל נקבת עכבר. לאחר לידת הגורים, ניתן לבודד את התאים המומרים וליצור פרופיל נרחב באמצעות טכניקות פרופיל הגנים העדכניות ביותר כגון ריצוף RNA של תא בודד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לסריקת CRISPR/Cas9 מהירה וישירה in vivo, המשתמשת בהזרקות לנטיוויראליות עובריות ברחם תחת הנחיית אולטרסאונד. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להעריך את תפקודיהם של מספר גנים בעור ובחלל הפה של עכברים בעלי מערכת חיסונית תקינה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- חקר הסרטן
רקע
- הטכניקה מאפשרת בחינה של תפקודי דיכוי גידולים של מאות גנים.
- היא יעילה מבחינה כלכלית בהשוואה למודלים קונבנציונליים של עכברי knockout.
- השיטה ניתנת להתאמה לבדיקת ביטוי גנים בעור.
- ניתן ליישמה עבור סוגי סרטן שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח מתודולוגיה להערכה סימולטנית של תפקוד גנים.
- שיפור ההבנה של תפקידי גנים בסרטן ראש וצוואר.
- אספקת כלי גמיש למחקר סרטן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקות לנטיוויראליות עובריות ברחם בהנחיית אולטרסאונד.
- שימוש באיסופלורן וחמצן להרדמה.
- אישור הריון באמצעות יישום קרם להסרת שיער.
- שימוש בפרוטוקול לספריית CRISPR ממוקדת.
תוצאות עיקריות
- הערכה מוצלחת של תפקודי גנים in vivo.
- הוכחת יעילות כלכלית של השיטה.
- אישור התאמה לסוגי סרטן שונים.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקרי תפקודי גנים.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע גישה מהירה ויעילה לניתוח תפקוד גנים.
- הוא פותח נתיבים חדשים למחקר סרטן ולמחקרי גנים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב מעבר לסרטן ראש וצוואר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקת CRISPR/Cas9 in vivo מאפשרת בחינה תפקודית מהירה ורב-ערוצית (multiplexed) של תפקידי גנים ברקמות עכבר הרלוונטיות למחלה, ובכך מאיצה את תיקוף המטרות (target validation) והפחתת הסיכונים המכניסטיים בגילוי תרופות אונקולוגיות. גישה זו מפחיתה את חסמי הזמן והעלות של מודלים גנטיים מהונדסים מסורתיים (GEMMs), ותומכת במיון ותיעדוף מוקדמים יותר של תיקי פיתוח המבוססים על נתונים. יכולת ההסתגלות שלה ברקמות שונות ובסוגים שונים של הפרעות גניות ממצבת אותה כפלטפורמה ניתנת להרחבה (scalable) לחדשנות במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה תפקודית סימולטנית של מאות גנים מועמדים למדכאי גידולים in vivo.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת תפקידי גנים בקרצינוגנזה ספציפית לרקמה.
- מסייע בבדיקה מהירה של היפותזות ובתעדוף מטרות לצורך תיקוף בהמשך התהליך.
סריקה ופיתוח בדיקה
- יוצר מודלים מאוששים של נוק-אאוט (knockout) מרובים (multiplexed) לסריקה חזקה של תפקוד גנים.
- מספק קריאות כמותיות באמצעות ריצוף דור הבא של ייצוג ה-sgRNA.
- משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) בהשוואה לזרימות עבודה של נוק-אאוט של גן בודד.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין מודלים פרה-קליניים לביולוגיה של מחלות בבני אדם על ידי אפשור הפרעה גנטית ספציפית לרקמה ולהקשר.
- תומך ברצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אפשור פרופיל של תאים בודדים (single-cell profiling) של תאים שעברו טרנסדוקציה.
- מפחית את הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים על ידי אספקת ראיות פונקציונליות מוקדמות, in vivo, עבור מטרות מועמדות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת סריקת CRISPR in vivo זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח מודלים פרה-קליניים, ובכך מאפשרת גנומיקה פונקציונלית ישירה ברקמות רלוונטיות לפני זיהוי המולקולה המובילה.
- ביולוגיה של גילוי: מאיץ בדיקת תפקודי גנים מונחית-השערה ומיפוי מסלולים במערכות רלוונטיות למחלות.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים ומרובי-פרמטרים להשוואה רחבה של הפרעות גנטיות.
- אנליטיקה: רותמת רצף דור הבא למדידה מדויקת של העשרה ודלדול של sgRNA.
- מחקר תרגומי: תומך בגילוי ביומרקרים ובתיאום מכניסטי עם פנוטיפים קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: פרוטוקול הניתן להתאמה לרקמות מגוונות, סטים של גנים ומודלים של מחלות לאורך תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת מטרות ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מייעל את יצירת המודלים, משפר את השחזוריות ומאפשר גנומיקה תפקודית בקיבולת גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת הקצאת ההון על ידי אספקת נתונים מוקדמים ומרובי-ערוצים (multiplexed) in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים וקידום של מטרות מאושרות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים בתוך הרחם (in utero), תכנון ספריות CRISPR וניתוח רצפים בשיטת next-generation sequencing.
- מחייב גישה למערכות הזרקה מונחות אולטרסאונד ויכולות לייצור lentiviral בטיטר גבוה.
- סטנדרזציה של ייצוג ספריית ה-sgRNA וההעברה הוויראלית היא קריטית לשחזור התוצאות.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לאיברים אחרים או לשיטות CRISPR אחרות באמצעות אופטימיזציה מתאימה.
- בקרת טיטר ויראלי ומדדי הזרקה קפדנית נחוצים כדי למנוע השפעות מטעות כתוצאה מהשתחלת מספר sgRNA.
