מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

מכיוון ש-Thermobia domestica הוא חרק בסיסי, מחקרים גנטיים על מין זה יאירו את המנגנונים העומדים בבסיס האבולוציה של חידושים מרכזיים בחרקים, כגון תעופה ממונעת ומטמורפוזות. פרוטוקול זה מכסה טכניקות בסיסיות מתחזוקת תרבית, ועד הזרקת ביצים ליישום תרמוביה כמין מודל מעבדה. שיטה זו יכולה לשמש גם ליישום של כלים גנטיים אחרים כגון הפלת גנים בתיווך RNI וטרנסגנזה בתרמוביה.

שמרו על אוכלוסיות פראיות ומוטנטיות במיכל פלסטיק גדול עם מזון דגים מלאכותי רגיל, מים בכוסות פלסטיק עם חור אוורור בחלקו העליון, נייר מקופל להסתרת החרקים וכותנה שכבתית להטלת ביצים. שמור את כל תרביות T.domestica בתוך אינקובטורים של 37 מעלות צלזיוס והגדר את הלחות היחסית בתוך כל מיכל ל-60 עד 80%כדי להכין את איסוף הביצים, מושבות העבירו כ-20 זכרים ו-20 נקבות בוגרות למיכל בגודל בינוני עם מזון, אספקת מים, נייר מקופל וחתיכה קטנה של כותנה שכבתית להטלת ביצים. הקימו מספר מושבות כדי להשיג מספר רב של עוברים בשלבים תוך פרק זמן קצר.

ביום ההזרקה החלף את הכותנה בתוך המיכלים בכותנה חדשה. שמונה שעות לאחר מכן אוספים את הביצים משכבות הכותנה על ידי הפרדת השכבות באמצעות מלקחיים. מיישרים את הביצים על הסרט הדו צדדי בעזרת מברשת צבע רטובה תוך שמירה על מרחק של שני מילימטר בין הביצים.

כל הביציות צריכות להיות מכוונות כך שציר האורך של הביצית פונה לצד ההזרקה. לחץ בעדינות על הביצים כלפי מטה בעזרת מברשת לאחיזה יציבה במהלך ההזרקה. טען שני מיקרוליטר של תמיסת gRNA CAS9 לתוך נימי הזרקת זכוכית עם מעמיס מיקרו.

ודא שאין בועות אוויר בתמיסה לפני ההזרקה. במידת הצורך הקש על המחט כדי להסיר את הבועות. ייעל את צורת קצה המחט על ידי שבירתו מעט עם מלקחיים כדי למנוע סתימה וכדי לקבל עמידות טובה יותר לאורך סדרת הזרקות.

הכנס את המחט בנקודת האמצע של ציר האורך של ביצה והזריק כמות קטנה מהתמיסה. התאם את התצורה של מזרק המיקרו האלקטרוני במהלך ההזרקה, בהתאם לצורת קצה המחט. שמור את הביצים המוזרקות במיכל בגודל מתאים עם לחות יחסית של 60 עד 80% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בדוק את הביצים המוזרקות מעת לעת והשליך ביצים פגומות כדי למנוע צמיחה פטרייתית. אם צומחת יותר מדי פטרייה על ביצה, נקה את פני הביצה עם 70% אתנול. לפני הבקיעה, טבלו את שקופית הזכוכית עם הביצים המוזרקות באבקת טלק כדי לצפות את פני הסרט הדו-צדדי.

זה ימנע ערימה של נימפות שבקעו. העבירו את מגלשות הזכוכית המצופות באבקה למיכל בגודל בינוני עם מזון, מים ונייר מקופל. בודד נימפות G1 ל -24 צלחות באר בעזרת שואב או מברשת.

שמור על אספקת מזון דגים רגיל מלאכותי. הניחו את 24 צלחות הבאר במיכל גדול יותר עם אספקת מים ללחות של 60 עד 80% צבטו ושלפו סרקוס מנימפה או מבוגר בעזרת מלקחיים ואספו אותם לצינור של 0.2 מיליליטר המכיל 50 מיקרוליטר אתנול. אחסן את הדגימות שנאספו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח הארוך.

הנח צינורות דגימה עם מכסים פתוחים על בלוק תרמי למשך 15 דקות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס כדי לאדות את האתנול. הזרקת קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין gRNA CAS9 בעוברים בשמונה השעות הראשונות לאחר הטלת הביצים מביאה לאינדלים באתר הממוקד של ה-gRNA. זה גורם למוטציות ביאלליות בחלק מהתאים של הדור המוזרק ובדרך כלל מתקבלים פנוטיפים מוטנטיים של פסיפס

כאשר נעשה שימוש בפרוטוקול זה להזרקת gRNA שתוכנן להתמקד בגן הלבן, 32.6% מהנימפות G0 הראו אובדן חלקי של פיגמנטציה בעיניים המורכבות ובאזורים הגביים שלהן. הערכת טרנספורמציה של קו הנבט של מבוגרים G0 ואנשים עם מוטציה G1 נעשתה על ידי PCR גנומי ואחריו בדיקת ניידות דופלקס הטרו. בדגימות G1, ניתן להבחין בבירור בדפוסי פס דיפרנציאלי בין דגימות מסוג בר לדגימות מוטציות.

עריכת גנום בתרמוביה מספקת גישה מוצקה לניתוח מנגנונים גנטיים העומדים בבסיס תכונות מוקדמות של חרקים. זה עוזר לחקור את הסודות מאחורי ההצלחה יוצאת הדופן שלהם ושלנו.