תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר
11 באפריל 2021
הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.
המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אוקריוטיים המסוגלים להנשמה אירובית. תפקודם הלקוי הוא מקור ידוע למחלה אנושית. המיטוכונדריה של שמרי בייקר מכילה קידוד גנום עגול שמונה חלבונים.
בסרטון זה, תיארנו את הפרוטוקול המשמש לחקר ביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה של שמרים באמצעות תיוג רדיואקטיבי של מוצרים תרגומיים והפרדה עוקבת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. ההליך כולל מספר שלבים עיקריים. שמרים פסים מתרבויות מלאי קפואות על צלחות טריות עם מדיום מתאים.
שים את הצלחות באינקובטור התרבות ב 30 מעלות במשך 24 עד 48 שעות. לחסן תרבויות אלה בשני מיליליטרים של מדיום מן הפס הטרי בצינור 15 מיליליטר ולהדגיר אותם לילה נסער ב 200 סל"ד ב 30 מעלות. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באורך הגל של 600 ננומטר.
קח את הנפח המתאים 0.2 יחידות ספיגה בתאי שמרים פלטת צינורות סטריליים ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט הזה. לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות.
תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט. לדלל תאים בשני מיליליטר של מדיום אגר ניגוב טרי.
קצה הדגירה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות עד הצפיפות האופטית מגיע מ 1.5 ל 1.9 מ 1.5 עד 1.9 ערכים. העבר את נפח התרבות שווה ערך ליחידה אופטית אחת בצינור מיקרו צנטריפוגה. לסובב את הצינורות ב3000 G לדקה אחת.
השלך את הסופרנט. לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות. תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר להשליך את supernatant.
להשעות מחדש את תאי השמרים ב 0.5 מיליליטר של מאגר תרגום סטרילי. מניחים את ההשעיה בצינור 15 מיליליטר. הוסף ציקלוהקסימיד להשעיית תאים עד ריכוז סופי של 0.2 מיליגרם לכל דגירה מיליליטר במשך חמש דקות קצה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות כדי לעכב תרגום ציטוזולי.
הוסף מ 25 כדי 30 להוסיף מ 25 כדי 30 מיקרוקורי של S35 מתונין של S35 מתונין כדי התא השעיה דגירה במשך 30 דקות קצה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות. הוסף מתונין קר ללא תווית ו borymycin להפסיק את הדגירה תיוג במשך 10 דקות קצה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות. לאסוף תאי שמרים על ידי צנטריפוגה ב 9, 000 G במשך 30 שניות.
לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות. תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט.
הוסף 75 מיקרוליטרים של מאגר תמוגה לפלטה ומערבולת במשך חמש עד 10 שניות. הוסף 500 מיקרוליטרים של 0.5 חוצץ tris טוחנת של 0.5 חוצץ tris טוחנת עם pH 6.8. עם pH 6.8.
וורטקס לזמן קצר. הוסף 600 מיקרוליטרים של מתנול לדגימה. וורטקס לחמש שניות.
הוסף 150 מיקרוליטרים של כלורופורם לדגימה. וורטקס לחמש שניות. צנטריפוגה הדגימות במשך שתי דקות ב 12, 000 G.בזהירות להשליך opaface עם סמפלר.
הוסף 600 מיקרוליטרים של מתנול לדגימה. מערבבים בזהירות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגימות צנטריפוגה במשך שתי דקות ב12, 000 G. להשליך supernatant.
אוויר לייבש את הפלט במשך שתי דקות ב 80 מעלות. ממיסים חלבונים מזורזים ב-60 מיקרוליטרים של מאגר מדגם לאמלי. מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 14 מעלות.
סיבה 17.5% Laemmli SDS פוליאקרילמיד ג'ל. טען 15 מיקרוליטרים של כל דגימה בכיסים. הפעל את הג'ל בחדר הקר עד הצבע הכחול מגיע כ 65% של הלימפה ג'ל.
הכתים את הג'ל בכחול מבריק של קומאסי ובצע סריקה או תמונה הנדרשת כבקרת טעינה. יבש את הג'ל במייבש הג'ל. שמור אותו בקלטת עם מסך זרחן אחסון במשך שלושה עד חמישה ימים.
סרוק את המסך על תמונה זרחנית. בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, הקצינו מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי משני זנים Saccharomyces cerevisiae. הסוג הפראי ומחיקת וריאנט המוטנטים של קידוד הגן Aim23 גורם ייזום תרגום מיטוכונדריאלי שלוש.
מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי כבר סומנו באופן פעיל והופרדו בג'ל פוליאקרילמיד דנאטורי. הדגימות נאספו כל שתיים וחצי דקות לפני הרוויה כדי לבנות את מסלול הזמן. הג'ל היה מוכתם, מיובש ומוקרן לאחר התערוכה בת חמשת הימים.
במקרה של ניסוי מוצלח, התמונה מדגימה שמונה להקות שהוקצו על פי התבנית הסטנדרטית. עם זאת, העוצמות של להקות בודדות יכולות להיות משתנות מאוד בהתאם למתח ולתנאים הניסיוניים. כל להקה מתאימה למוצר תרגום אחד.
הנתונים מצביעים על כך שזן המוטנטים מסוגל לסינתזת חלבונים מיטוכונדריאליים מכיוון שכל המוצרים המופיעים בסוג הפראי נראים במוטנט זה. עם זאת, העוצמות של הלהקות שונות מהסוג הפראי, כלומר מחיקה זו של Aim23 משפיעה על ביטוי הגן המיטוכונדריאלי. קומאסי מבושל בכתם כחול ומשמש כבקרת טעינה.
ניתן לכמת את התוצאה שלהם בנתונים כדי לזהות הבדלים בין זנים או תנאים ניסיוניים באמצעות תוכנת Image G או Image Quan. עבור אלה, היחס בין האות המתאים לכל מוצר מחושב לאות הכולל. ערכים ממוצעים וסטיות תקן מחושבים בשלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות.
הקינטיקה של חלבון מסונתז שהתהפך נחקרת בניסוי שנערך בשנה שעברה. דגימות נאספות בנקודות הזמן שצוינו לאחר תגובת התיוג נעצרת על ידי מתיונין קר ו borymycin. בקרה זו נחוצה כדי להעריך את יציבות המוצר.
מכתים אימונים עם נוגדנים נגד פורין אחד הוא בקרת טעינה. תיארנו את השיטה, המשמשת לעתים קרובות לחקר ביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה של שמרים. פרוטוקול זה הוא פשוט יחסית ומהיר לביצוע.
במקביל, הוא מאפשר לקבל מידע רב ערך על שיעור התרגום של ארבעה שמרים מיטוכונדריאלי mRNAs, וזה יתרון מאוד. עם זאת, יש לו מספר מגבלות הדורשות ניסויים נוספים טמון זה רמות interstate של חלבונים mRNAs. זה יכול לספק את המידע על פונקציות אלה במערכת תרגום מיטוכונדריאלי, אבל טכניקות מתקדמות יותר יש להשתמש כדי לגלות את המנגנון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לסימון והדמיה של שמונת הפוליפפטידים המקודדים על ידי הגנום המיטוכונדריאלי של שמר האפייה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
רקע
- מיטוכונדריה חיוניות לנשימה אירובית בתאים איקריוטיים.
- שיבוש בתפקוד המיטוכונדריה קשור למגוון מחלות אנושיות.
- לשמר Bakers yeast יש גנום מיטוכונדריאלי מעגלי.
- גנום זה מקודד לשמונה חלבונים חיוניים.
מטרת המחקר
- לסימון כל הפוליפפטידים המקודדים על ידי הגנום המיטוכונדריאלי של השמרים.
- להצגת הפוליפפטידים הללו כפסים נפרדים.
- לשיפור ההבנה של הביוסינתזה של חלבונים מיטוכונדריאליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון רדיואקטיבי של תוצרי תרגום.
- הפרדה של חלבונים מסומנים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
- מריחה של שמרים מתרביות מאגר קפואות על צלחות טריות.
- שימוש במצע מתאים לצמיחת שמרים.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של כל שמונת הפוליפפטידים המיטוכונדריאליים.
- הדמיה של הפוליפפטידים כפסים נפרדים על ג'ל.
- הדגמה של יעילות הפרוטוקול במבחני ביוסינתזה של חלבונים.
- תובנות לגבי תפקוד המיטוכונדריה וסינתזה של חלבונים.
מסקנות
- הפרוטוקול מסמן ומדגים ביעילות חלבונים מיטוכונדריאליים.
- ניתן ליישם שיטה זו במחקרים נוספים על תפקוד המיטוכונדריה.
- הבנת תהליכים אלו חיונית לטיפול במחלות מיטוכונדריאליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סימון כמותי וויזואליזציה של תוצרי תרגום מיטוכונדריאליים ב-Saccharomyces cerevisiae מאפשרים בחינה מדויקת של ביטוי גנים מיטוכונדריאליים וביוסינתזה של חלבונים. יכולת זו היא קריטית להסרת סיכונים מנגנוניים בשלבי גילוי מוקדמים, במיוחד בעת הערכת ההשפעה של הפרעות גנטיות על תפקוד האברונים. השיטה תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים השוואתיים חסונים על תרגום מיטוכונדריאלי על פני זנים של טיפוס פרא וזני מוטציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של קצבי התרגום המיטוכונדריאלי לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין השפעות של שינויים גנטיים על סינתזה של חלבונים מיטוכונדריאליים.
- מקל על ביצוע ניתוח השוואתי בין זנים מסוג בר (wild-type) לזנים מוטנטיים כדי להבהיר תלויות במסלולים ביולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק זרימת עבודה מתוקתקת לבידוד וכימות של תוצרי תרגום מיטוכונדריאליים.
- מספק דפוסי פסים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה וסריקות המשך.
- מאפשר זיהוי מהימן של פגמים ביוסינתטיים עבור קמפיינים של סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימים את תוצרי התרגום המיטוכונדריאלי למודלים הרלוונטיים למחלה כאשר מעורבת תפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של ביטוי גנים מיטוכונדריאליים.
- מספק תובנות מכניסטיות לגבי פגמים בתרגום הרלוונטיים לפתולוגיה של המיטוכונדריה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לתיקוף במודלים פרה-קליניים, שבהם תפקוד מיטוכונדריאלי מהווה מדד מרכזי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות כימות של תרגום חלבונים המקודדים במיטוכונדריה תחת רקעים גנטיים שונים.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואה של קצבי ביוסינתזה בין תנאים שונים.
- אנליזה: מאפשר ניתוח סטטיסטי של עוצמות הפסים להשוואת יעילות ויציבות התרגום.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני תרגום מיטוכונדריאלי לפנוטיפים רלוונטיים למחלות במודלים של שמרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לניתוח תרגום מיטוכונדריאלי על פני התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות מיטוכונדריאליות ובמחקרים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים להרחבה וניתנים לשחזור לניתוח תרגום מיטוכונדריאלי.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים והשוואתיים על ביוסינתזה מיטוכונדריאלית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות ומודלים מותאם סיכון בהתבסס על תוצאות התרגום המיטוכונדריאלי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של שמרים, סימון רדיואקטיבי ואלקטרופורזה של חלבונים.
- נדרשת גישה לתשתית של דימות פוספורי (phosphorimaging) וניתוח כמי של ג'לים.
- דורש בקרות קפדניות ושחזורים להבטחת מהימנות הנתונים ויכולת השוואה בין צוותים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור ספציפיות התרגום.
- פרשנות של קצבי התרגום חייבת להתחשב בניסויים נוספים להסקת מסקנות מכניסטיות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:39
Preparation of Yeast Culture
2:10
Radioactive Isotope Incorporation
3:34
Yeast Cell Lysis and Extraction of Proteins
4:20
Precipitation of Proteins
5:15
Electrophoretic Separation
5:43
Autoradiography
5:59
Representative Results
7:56
Conclusion
