הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה
10 באפריל 2021
מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בהדמיה חיה כדי לדמיין את ההשפעות של נזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של מבנים תת תאיים בשחלות Drosophila.
המעבדה שלנו משתמשת במלנוגאסטר Drosophila כדי לזהות ולאפיין גנים ומסלולים המווסתים את תפקוד המיטוכונדריה במהלך התפתחות והומאוסטזיס פיזיולוגי. הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בהדמיה חיה עם תוספת של מי חמצן כדי לדמיין את ההשפעות של נזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של מבנים תת תאיים בשחלת Drosophila הבוגרת. לעתים קרובות אנו משתמשים בפרוטוקולי הדמיה כדי לחקור כיצד מוטציות משנות לוקליזציה מיטוכונדרית תקינה ותנועה בתאי נבט נקבה.
במהלך המחקרים שלנו מצאנו כי מתח הציג על ידי ניתוח או לחצים אחרים התא היתה השפעה עמוקה על לוקליזציה מיטוכונדריאלי. כבקרה כדי לזהות אם מתח כללי, בניגוד לטיפול ניסיוני, הוא הגורם לשינויים בלוקליזציה או בהתנהגות של מבנים תת-תאיים. פיתחנו פרוטוקול זה כדי להציג מתח שליטה באמצעות מי חמצן.
בסרטון זה, אנו נדגים כיצד מי חמצן המושרה נזק חמצוני משנה את ההפצה של המיטוכונדריה ואת ריבונוקלאופרוטאין Clu. אמצעי התקשורת המתאימים ביותר לטכניקת הדמיה חיה זו הכילו את מדיית דרוזופילה של שניידר שהכילה 15% סרום שור עוברי מומת בחום, 0.6 X Pen-Strep ו-200 מיקרוגרם לאינסולין שור מיקרוליטר, להלן מדיה שלמה של שניידר. ביצוע ההכנה התקשורתית בתנאים סטריליים יבטיח שהיא לא תזוהם.
מערבבים היטב את התכולה ומאחסנים לילה בארבע מעלות. האינסולין אינו מתמוסס לחלוטין במדיה המלאה של שניידר ותבחינו במשקע המתיישב בתחתית הצינור. הפוך aliquots, להיות בטוח לעזוב את המשקעים כפי שהוא יפריע הדמיה.
פתרון זה עשוי לשמש במשך חודש אחד אם מאוחסן aliquots בארבע מעלות. להדמיה אופטימלית של תאי נבט נשיים, הכינו תחילה בקבוקון המכיל טיפה של משחת שמרים רטובה שהיא עקביות של חמאת בוטנים. זה מבטיח שהנקבות מוזנות היטב וייצרו את כל שלבי התפתחות הזקיק להדמיה.
עבור זבובים בריאים בצורה אופטימלית, לאסוף אפס עד יום אחד נקבות ישנות ולהעביר עם זכרים לתוך בקבוקון מזון זבוב המכיל הדבק שמרים רטובים. ודא זבובים ישנים לא ליצור קשר עם הדבק שמרים כפי שהם יכולים לדבוק בו. להאכיל את הזבובים שלושה עד שבעה ימים, שינוי הדבק שמרים מדי יום.
ודא הדבק שמרים קשר עם מזון לטוס, כך שזה לא להתייבש. כדי לגרום נזק חמצוני, נשתמש בתמיסת מלאי של 30% מי חמצן כדי לדמיין מיטוכונדריה, נשתמש בתמיסת מלאי של 100 מילימולאר TMRE. חשוב להכין את פתרונות המדיה טריים כי מי חמצן רגישים חמצון TMRE משפיל לאורך זמן.
רגע לפני הניתוח, במדיה המלאה של שניידר, הכינו אליגוט טרי של שני מי חמצן מיקרומולאריים, אליגוט טרי של 46 ננומולאר TMRE, ו aliquot טרי של 46 ננומולאר TMRE בתוספת שני מי חמצן מיקרומולארי. לניתוח השחלות תצטרך שני זוגות של מלקחיים עדינים וזוג מחטי טונגסטן מחודדות אלקטרוליטיות. כדי לנתח את השחלות למלא שעון עם מדיה מלאה של שניידר כי כבר מחומם לטמפרטורת החדר, ואז למקם זבוב אחד בתקשורת באמצעות מלקחיים.
בעדינות לתפוס את הזבוב על ידי בית החזה באמצעות זוג אחד של מלקחיים עדינים. עם מלקחיים אחרים, לתפוס את האחורי בעדינות למשוך כדי להסיר את השחלות. הסר כל קוטיקולה או רקמה חוץ גופית, ולאחר מכן להעביר את השחלה לבאר חדשה המכילה מדיה טרייה.
השחלות עדיין צריכות לנוע ממעטפת השרירים שמסביב. באמצעות מחטי טונגסטן מחודד, בעדינות להקניט לגזרים את ovarioles, מקפיד להסיר את נדן השריר שמסביב. אם נדן השריר לא יוסר, כפי שהוכח כאן, אובריה יהיה עווית, גרימת בעיות עם רכישת תמונה.
לאחר ovarioles נותחו בצורה נקייה, להעביר אותם טיפה 100 מיקרוליטר של מדיה לצלחת MatTek אם לדמיין מבנים מסומנים אנדוגני. העבר את ovarioles בירידה 100 מיקרוליטר של מדיה TMRE לצלחת MatTek אם לדמיין מיטוכונדריה שכותרתו TMRE. ה"אובריולס" ישקעו לתחתית הטיפה.
חשוב לתרגל ניתוחים על מנת להתחיל לדמיין את הרקמה מהר ככל האפשר. לאחר ovarioles מותקן, מניחים את המנה על מיקרוסקופ הפוך לרכוש תמונות סטילס או קטעי וידאו קצרים כתיעוד של תנאי טיפול מקדים. ברגע שזה נעשה, להשהות את ההדמיה החיה, להסיר את המכסה, בזהירות להוסיף 100 microliters של שני פתרון מי חמצן מיקרומולאר מוכן.
הימנע לשבור את פני השטח של טיפת התקשורת הקיימת או להוסיף את הפתרון מהר מדי, כדי לא לעקור את ovarioles נח על החלק התחתון. החלף את כיסוי המנה, העבר ומקד מחדש את ovariole הרצוי, ולחדש את ההדמיה. יש להקפיד לחדש את ההדמיה במהירות האפשרית, שכן הטיפול הניסיוני רגיש לזמן.
מוצגים כאן תמונות סטילס מסרט, שצולמו לאחר טיפול מי חמצן. המיטוכונדריה ותאי הנבט הנשי מפוזרים לאורך הציטופלסמה כאשר הזבובים מוזנים היטב ובריאים. לאחר תוספת מי חמצן, הנזק החמצוני גורם מיטוכונדריה כדי clump, אשר ניתן לראות מהר כמו 10 דקות לאחר הטיפול.
לאחר 20 דקות, הנזק גורם לפוטנציאל הקרום המיטוכונדריאלי להתפוגג. לכן, רוב המיטוכונדריה לדעוך. בסרט חי זה של התהליך, המיטוכונדריה ניתן לראות במהירות גושים ואת רוב המיטוכונדריה בסופו של דבר לדעוך.
המצמוץ הפועם בציטופלסמה, במיוחד בתאי הזקיק שמסביב, נראה אופייני לתוספת TMRE. כפי שהוזכר קודם לכן, ההדמיה חייבת להתבצע במהירות לאחר תוספת מי חמצן. כפי שמוצג כאן, אם חלף זמן רב מדי, פוטנציאל הקרום המיטוכונדריאלי כבר אבד ותיוג TMRE מתפוגג, מה שהופך את הנתונים לבלתי ניתנים לפרשנות.
בתמונות סטילס אלה וידאו, GFP שכותרתו אנדוגני חלקיקי Clu הם חזקים ושופע ב germplasm של נקבות ניזון היטב. לאחר תוספת מי חמצן, חלקיקי קלו להתפזר בתוך 10 דקות. זה בא לידי ביטוי בסרטון הנלווה.
לאחר תוספת מי חמצן, חלקיקי אושר Clu להתפזר במהירות. מצאנו פרוטוקול זה להיות כלי שימושי כדי להבטיח הדמיה מדויקת של לוקליזציה מסוג פראי של חלקיקי מיטוכונדריה ואושר קלו בתאי נבט נקבה Drosophila. פרוטוקול זה צריך להיות ישים עבור מגוון רחב של מחקרי הדמיה חיה והוא יכול לשמש לטיפול ברקמות לפני הקיבעון גם כן.
הצעדים החשובים ביותר הם לבודד ovarioles ללא נדן השריר, להוסיף בעדינות את מי חמצן, כדי לא לעקור את ovarioles, כדי תמונה במהירות לאחר תוספת מי חמצן. אנו מקווים שתמצאו את זה שליטה שימושית עבור הדמיה חיה מגוון רחב של מבנים תת תאיים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים דימיון חי של שחלאות Drosophila melanogaster להצגת ההשפעות של נזק חמצוני על מבנים תת-תאיים, ובייחוד על מיטוכונדריה וחלקיקי Clu bliss. על ידי הוספת מימן-פרוקסיד להשראת סטרס חמצוניי מבוקר, חוקרים יכולים להעריך שינויים במיקום ובדינמיקה של מבנים אלו בזמן אמת. שיטה זו מהווה בקרת ערך חשובה להבחנה בין השפעות ניסיוניות לבין סטרס תאי כללי במהלך דימיון חי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
- דימות תאים חיים
- גנטיקה של Drosophila
רקע
- דימיון חי של שחלאות Drosophila נמצא בשימוש נרחב לחקר תהליכים תאיים כגון תנועת אבנים תת-תאיות ודינמיקה של השלד התאי.
- דיסקציה ומניפולציה עלולות לגרום למעקה תאי, כולל היפוקסיה ונזק חמצוני.
- מעקה חמצוני עלול לשנות את מיקום מבנים תת-תאיים, מה שעלול להטעות את תוצאות הניסוי.
- מימן פראוקסיד הוא חומר נפוץ, מהיר וזול להשראת נזק חמצוני in vitro.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול להשראה וויזואליזציה של נזק חמצוני בשחלות של Drosophila במהלך דימוי חי (live imaging).
- מתן בקרה להבחנה בין השפעות של עקה תאית כללית לבין טיפולים ניסיוניים ספציפיים.
- הדגמת ההשפעה של נזק חמצוני על מיטוכונדריה ועל חלקיקי Clu bliss.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מצע שניידר (Schneider's media) מלא עם תוספים לצורך דיסקציה של השחלות והדמיה.
- האכלה והכנה של זבובים נקבות בריאים כדי להבטיח נוכחות של כל שלבי הפיתוח של הזקיקים.
- דיסקציה של השחלות והסרה של מעטפת השרירים להדמיה אופטימלית.
- הדמיה חיה של אובריולות (ovarioles) לפני ואחרי הוספת מי חמצן (2 μM) ו-TMRE לוויזואליזציה של המיטוכונדריה.
- הוספה זהירה של מי חמצן כדי למנוע תזוזה של הרקמה, והדמיה מהירה לאחר הטיפול.
תוצאות עיקריות
- נזק חמצוני המושרה על ידי מימן פחמונית גורם למיטוכונדריה להתקבץ במהירות ולאבד את פוטנציאל הממברנה, כפי שניתן לראות באמצעות סימון TMRE.
- חלקיקי Clu bliss, העמידים בתאים בריאים, מתפזרים תוך 10 דקות של עקה חמצונית.
- יש לבצע את הדימות במהירות לאחר הוספת מימן פחמונית כדי ללכוד שינויים דינמיים לפני אובדן האות.
- הפרוטוקול משמש כביקורת מהימנה להערכת ההשפעה של עקה כללית על מיקום תת-תאי.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר השראה מבוקרת והדמיה של נזק חמצוני בשחלות של Drosophila במהלך דימוי חי (live imaging).
- הוא ישים באופן רחב לחקר מבנים תת-תאיים שונים ויכול לשמש כביקורת בניסויי דימוי חי.
- שלבים מרכזיים כוללים הכנה קפדנית של הרקמה, הוספה עדינה של hydrogen peroxide ודימוי מהיר להבטחת איכות הנתונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
השראה מבוקרת של נזק חמצוני בתאי ביצים של Drosophila באמצעות דימיון חי מאפשרת הערכה מדויקת של דינמיקת מבנים תת-תאיים תחת עקה, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מספקת ביקורת חסונה להבחנה בין השפעות ניסיוניות לבין עקה תאית כללית, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי במחקרי תיקוף מטרות. יכולת ההסתגלות של הפרוטוקול למבנים תת-תאיים שונים מעלה את ערכו עבור פיתוח בדיקות לכלל הפורטפוליו ומוכנות לסריקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של שינויים במיקום ובדינמיקה של אברונים המושרים על ידי עקה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של התנהגות מיטוכונדריה וחלקיקי ריבנוקליאו-פרוטאין תחת תנאים חמצוניים מבוקרים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין השפעות טיפול ספציפיות לבין תגובות עקה תאיות כלליות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי דימוי תאי חיים המשכיים.
- מנרמל את השראת העקה החמצונית לקבלת תוצרי דימוי כמותיים הניתנים לשחזור.
- מאפשר הערכה מהירה של השפעות תרכובות או הפרעות גנטיות על מבנים תת-תאיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים רלוונטיים למחלה המערבים עקה חמצונית ותפקוד מיטוכונדריאלי לקוי.
- מספק רצף מדימוי בשלב הגילוי ועד לתיקוף של תגובות עקה תאיות במודלים פרה-קליניים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי הבהרת פנוטיפים מושרי עקה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול דימוי חי זה משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמת, דרך פיתוח בדיקות ועד לתיקוף פרה-קליני, ובמיוחד עבור מחקרים העוסקים במעס תאי ובדינמיקה של אברונים.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על השפעת נזק חמצוני על לוקליזציה תת-תאית.
- סריקה: מספק פלטי דימוג כמותיים וניתנים לשחזור לצורך אנליזה השוואתית.
- אנליטיקה: מספק מדדים מדידים של התקבצות מיטוכונדריאלית ופיזור חלקיקי ריבונוקלאו-חלבון.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תגובות למעקה חמצוני ב-Drosophila למודלים רחבים יותר של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול לשימוש חוזר למחקרים מגוונים של מבנים תת-תאיתיים בין צוותי מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייחד את תהליכי העINדוק של עקה חמצונית וזרימות העבודה של דימוג לצורך יכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי הבהרה של פנוטיפים הקשורים לעקה בשלב מוקדם של התהליך.
- השפעה על תיק הפרויקטים: מאפשר תעדוף של מטרות ומודלים מותאם-סיכון בהתבסס על נתוני תגובת עקה חסונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח Drosophila ובטכניקות של דימיון חי (live imaging).
- נדרשת גישה למיקרוסקופיית פלואורסצנציה הפוכה ולריאגנטים מתאימים לדימיון.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים להשראת עקה חמצונית (oxidative stress).
- ניתן להסתגל למבנים תת-תאיים שונים אך מוגבל למדיומים מימיים (אינו תואם לשמן הלוקרבון).
- יש לבצע את הדימיון במהירות לאחר הטיפול כדי ללכוד שינויים דינמיים לפני אובדן האות.
