סינון מקטעים מבוסס NMR במדגם מינימלי אך במצב אוטומציה מקסימלי
4 ביוני 2021
סינון מבוסס מקטעים על ידי NMR הוא שיטה חזקה לזיהוי מהיר של קושרי מולקולות קטנות לביומקרומולקולות (DNA, RNA או חלבונים). מוצגים פרוטוקולים המתארים הכנת דגימות מבוססת אוטומציה, ניסויי NMR ותנאי רכישה ותהליכי עבודה של ניתוח. הטכניקה מאפשרת ניצול אופטימלי של גרעינים פעילים של 1H ו-19F NMR לצורך גילוי.
אנו עורכים מחקרי תהודה מגנטית גרעינית. זה מאפשר לנו לקבוע את המבנים של חלבונים, רנ"א ודנ"א בתמיסה. ביומולקולות אלה הן המרכיבים, הן המרכיבים של התאים שלנו, והפרוטוקולים שאנו מציגים כאן עוסקים בסינון של מולקולות קטנות וקשירתן למטרות אלה.
ממולקולות אלה, הכימיה הרפואית והביולוגיה המבנית שלנו יכולות להפיק תרופות חדשות הנלחמות במחלות. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שיש לנו שליטה מלאה על איכות המטרות המולקולריות, כמו החלבונים, ויש לנו שליטה מלאה על איכות מקטעי המולקולות הקטנות והתרופות, ואנחנו יכולים גם לסנן חלבונים לקשירה של מגוון רחב של זיקות, וזה יתרון בהשוואה למתודולוגיות אחרות. כדי להכין דגימות מסך למדידת NMR, השתמשו ברובוט להכנת דגימות כדי לפזר 768 תרכובות לשמונה צלחות של 96 בארות כדי לקבל 64 תערובות המכילות 12 מקטעים לריכוז סופי של 4.2 מילימולר לתערובת.
העבר את המטרה הביומולקולרית המעניינת, מדוללת במאגר סינון מתאים, למספר המתאים של צינורות מחליפי דגימות NMR בתפוקה גבוהה של שלושה מילימטר ברקוד, והשתמש ברובוט כדי להעביר 10 מיקרוליטר מכל תערובת ליגנד לכל צינור של ביומולקולת המטרה. לאחר מכן, בקש מהרובוט לערבב את הפתרונות ביסודיות. עבור רכישת NMR, טען את הדגימה לתוך הספקטרומטר.
פתח את תוכנת הספקטרומטר, ולאחר מכן, בחר את ערכת הפרמטרים ואת רצפי הפולסים עבור ניסויים מבוססי ליגנד. עבור כל הניסויים המפורטים, בחר פיסול עירור כדיכוי מים. לבדיקת פלואור-19, בחר הן ניסויי 1D והן ניסויי T2.
בחר את הרוחב הספקטרלי ל -220 חלקים למיליון, את תדירות העירור ל -140 חלקים למיליון, ואת זמן הניתוח בין שעה לחמש שעות. עבור T2, זמן CPMG צריך לסירוגין בין 5 ל 100 אלפיות השנייה. הקלט את ניסויי T1r ו- T2.
רשום את הפרש העברת הרוויה כפסאודו דו-ממדי. כדי לעבד את שני ספקטרום 1D יחיד, השתמש בתוכנית AU ProcStd פונקציה, עם או בלי אפשרות הרפיה. WaterLOGSY הוא 1D יחיד כי צריך להיות פאזי עם שלילי עבור אות ממס.
כדי לנתח את נתוני סינון המימן, עקוב אחר ההוראות עבור כלי הסינון מבוסס המקטעים לאחסון נתוני NMR בתהודה מגנטית ביומולקולרית ממסעות סינון, כך שלכל תערובת סינון יש ספרייה משלה שבה תת-ספרייה מכילה את הניסויים השונים שנמדדו על הדגימה. אחסן את ספקטרום הייחוס, עם כל הנתונים שנשמרו מהדגימות ללא המטרה הביומולקולרית, אלא עם התערובות והתרכובת היחידה בספריות שונות. צור נתיב ישיר לספרייה המכילה את הנתונים שנרכשו, ובחר בספריית NMR שבה לכל התערובות צריכה להיות ספרייה נפרדת.
ודא שה- CSV, מסך הפרגמנט, מסמך XML וקבצי BAC מועתקים גם לספריית NMR של הנתונים. כדי להשתמש בכלי סינון מבוסס מקטע עבור דגימה שהוקרנה, גרור את סמל פרויקט הסינון המבוסס על מקטע למרכז חלון הניתוח. הסמל אמור להופיע אם ערכות הנתונים שנשמרו בעבר הועתקו לתוכו.
חלון אפשרויות הסינון המבוסס על מקטע אמור להיפתח אוטומטית. בחר קובץ קוקטייל CSV המכיל את שמות התערובות, את שמות כל קטע ואת החלוקה של כל קטע לתערובות. הגדר תיקיית ספקטרום ליגנד ייחוס עם כל הספקטרום הנמדד של המקטעים הבודדים, והגדר תיקיית ניסוי ריקה של ייחוס, המכילה בדרך כלל את ערכות הנתונים של התערובות ללא היעד הנחקר.
להגדרת צבעי התצוגה של הספקטרום והספקטרום שנחקרו, פתחו את הכרטיסיה 'סוגי ספקטרה' וקבעו את סוג המפרט בהתאם לנתוני התהליך. בכרטיסיה פריסת תצוגה, הגדר את הספקטרום שיושווה בהתאם לסוגי המפרט. לאחר מכן, לחץ על אישור כדי להתחיל את הפרויקט.
בזמן עיבוד הנתונים, ייפתח חלון נפרד עם טבלה המסכמת את כל תערובות הקוקטיילים והליגנדות של כל מיקס. לחץ פעמיים על תא כדי לפתוח את ערכות הנתונים המתאימות. לפני הקצאת קלסרים, ודא שפסגות הייחוס תואמות זו לזו ובעלות אותו שינוי כימי.
אם נצפים הבדלים, פתח את הכרטיסיה תהליך והשתמש באפשרות העיבוד הטורי כדי לתקן אותם. לניתוח הראשון על תערובות פלואור-19, פתח את הכרטיסייה ניתוח ובחר את פונקציית השילוב. ודא שמוגדר אזור אינטגרציה ברור עבור אות פלואור-19 המתאים לכל קטע בתערובת.
שמור אזורי שילוב ייצוא כדי לייצא את קובץ השילוב לשימוש עתידי, ושמור את כל קבצי השילוב המשומשים בספריית ההתקנה המתאימה. עבור נתוני פלואור-19, פתח ערכת נתונים עם או בלי היעד הנחקר, ותחת הכרטיסיה נתח, לחץ על שלב וקרא אזורי שילוב ייבוא כדי לטעון את קובץ השילוב המתאים לספקטרום הנוכחי. לאחר מכן, לחץ על שמור וחזור כדי לאתר רשימה של האזורים המשולבים בכרטיסיה אינטגרלים, והעתק מידע זה לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח במורד הזרם.
המבנה המולקולרי או המבנה המולקולרי של הליגנדות בספריית המקטעים מנותח באמצעות תוכנת ביטחון מולקולרית כפי שהודגם והתוצאות מוצגות כפלט גרפי. צבע כתום מציין שהשבר מפגין חוסר עקביות במבנה או בריכוז. בארות בצבע ירוק מעידות על עקביות השבר.
בניתוח מייצג זה, 103 קטעים המכילים קבוצת פלואור אחת או יותר מהספרייה הפנימית חולקו לחמש תערובות של 20 עד 21 שברים לתערובת. ניסויי הרפיה רוחביים של פלואור-19 נמדדו עבור כל תערובת שהפעילה רכבות דופק CPMG. ערכי סף שימושיים להגדרת קושר, קושר חלש או לא קושר בתערובת, כפי שנצפה בחלבון תיאמין טיפוסי זה טירוזין קינאז A וספקטרום RNA.
בניתוח מייצג זה, פגע אחד הראה ירידה T2 של כ -50% ושינוי כימי גדול או שווה לשישה הרץ. ה- WaterLOGSY לא הראה שינוי משמעותי באות כדי להיספר כחיובי. עם זאת, מכיוון ששניים מתוך שלושה ניסויים היו חיוביים, קטע זה נחשב להיט.
עבור מכה שנייה, T2 הראה ירידה של כ -80% בעוצמת האות. שינוי אות ברור נצפה גם עבור WaterLOGSY. השינוי הכימי לא הספיק בניסוי זה, אך מכיוון ששני הקריטריונים הקודמים היו חיוביים, הוא עדיין נחשב להיט.
המטרה הסופית של שיטות כאלה היא לפתח תרופות חדשות או מעכבי זיקה גבוהה של, למשל, אנזימים, ובכך, הכימיה הרפואית משתלטת ומסנתזת את המולקולות החדשות האלה, אבל ביולוגיה של מבנה, הטכניקות שאתה מיישם כאן יכולות להנחות את הכימיה הרפואית ולהפוך את הגישה הזו להרבה יותר מהירה.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט זרימת עבודה מתקדמת לסריקה מבוססת מקטעים (FBS) בתפוקה גבוהה באמצעות ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR). הפרוטוקול מאפשר זיהוי יעיל של מקשרים מסוג מולקולות קטנות למטרות ביומולקולריות כגון חלבונים ו-RNA, תוך ניצול אוטומציה, הכנה אופטימלית של דגימות וכלים מתוחכמים לניתוח נתונים כדי להאיץ את גילוי התרופות ופיתוח גששים כימיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- כימיה רפואית
- גילוי תרופות
- ספקטרוסקופיית NMR
רקע
- סריקה מבוססת פרגמנטים (Fragment-based screening) היא גישה מרכזית בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות.
- סריקה מבוססת פרגמנטים באמצעות NMR מציעה רגישות גבוהה לזיהוי קשירה (binders) על פני טווח רחב של זיקה (affinity).
- בקרת איכות של ספריות פרגמנטים ומטרות ביו-מולקולריות חיונית להשגת תוצאות מהימנות.
- סריקה ידנית מגבילה את התפוקה ואת הנגישות, במיוחד במסגרות אקדמיות.
מטרת המחקר
- להציג זרימת עבודה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה עבור FBS המבוססת על NMR.
- להדגים פרוטוקולים לסריקת פרגמנטים של מולקולות קטנות מול חלבונים ו-RNA.
- לשפר את היעילות, איכות הנתונים והשחזור במסעות סריקת פרגמנטים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה אוטומטית של דגימות באמצעות רובוט להפצת תרכובות לתוך תערובות ולנבובות NMR.
- שימוש במחליפי דגימות NMR בעלי תפוקה גבוהה, המסוגלים לטפל בלמעלה מ-500 דגימות בבלוקים בעלי בקרת טמפרטורה.
- רכישת ספקטרומים של NMR מבוססי ליגנד של 1H ו-19F, כולל ניסויי 1D, T2 (CPMG), T1r, WaterLOGSY והפרש העברת רוויה (saturation transfer difference).
- עיבוד וניתוח נתונים באמצעות תוכנה ייעודית לסריקה מבוססת פרגמנטים, כולל אינטגרציה, התאמה למקור ייחוס והקצאת קושרים.
תוצאות עיקריות
- תהליכי עבודה אוטומטיים מאפשרים הכנה וסריקה מהירות וניתנות לשחזור של ספריות פרגמנטים גדולות.
- שלבי בקרת איכות מזהים פרגמנטים שאינם עקביים או שאינם טהורים באמצעות תוכנה לאמינות מולקולרית.
- ניתוחים מייצגים מדגימים זיהוי של קשירים (binders) בהסתמך על שינויים ב-T2 relaxation, בהסתות כימיות (chemical shift) ובאותות WaterLOGSY.
- נקודות סף לסיווג קשירים נקבעו, ובכך תומכים בזיהוי חזק של פגיעות (hits).
מסקנות
- סבב העבודה המתואר המבוסס על NMR עבור FBS משפר באופן משמעותי את התפוקה ואת איכות הנתונים בסריקת פרגמנטים.
- אוטומציה וכלי תוכנה מתקדמים מפחיתים את המאמץ הידני ואת השגיאות, ובכך הופכים את הגישה לנגישה עבור קהילת מחקר רחבה יותר.
- מתודולוגיה זו מאיצה את הזיהוי של תרכובות מובילות (lead compounds) עבור גילוי תרופות ויישומים בביולוגיה כימית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקת פרגמנטים מבוססת NMR עם אוטומציה נותנת מענה לצוואר בקבוק קריטי בתהליכי גילוי תרופות מוקדמים, על ידי אפשור זיהוי כמותי בסביבת תפוקה גבוהה של קושרים ממולקולות קטנות למגוון מטרות ביו-מקרומולקולריות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי פגיעות (hits), מפחיתה תוצאות חיוביות ושליליות שגויות, ותומכת במיון יעיל של פורטפוליו בשלבי תיקוף המטרה וזיהוי המולקולות המובילות (lead identification). שילוב של חומרה ותוכנה מתקדמות מבטיח תהליכי עבודה ניתנים להרחבה ולשחזור, החיוניים להשפעה על מחקר ופיתוח (R&D) ברמת הארגון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של אינטראקציות בין מטרה לליגנד בחלבונים ו-RNA ברגישות גבוהה.
- תומך בתיקוף תפקודי של המטרה על ידי כימות זיקות קישור (binding affinities) בטווח דינמי רחב.
- מפחית עמימות מכניסטית באמצעות בקרת איכות קפדנית הן של המטרות והן של הפרגמנטים.
- מסייע בהגברת הביטחון החזוי ובמיון יעיל של פגיעות פרגמנט (fragment hits) לצורך המשך עבודה בכימיה רפואית.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- הכנה אוטומטית של דגימות ורכישת NMR בשפיות גבוהות מבצעות סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה והתוצאות.
- מספק קריאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכה מהימנה של תרכובות ותיעדוף פגיעות (hits).
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה של ספריות פרגמנטים גדולות ומגוונות עם מינימום התערבות ידנית.
- מספק מבני נתונים מתוקפים וספקטרא של ייחוס לצורך שימוש חוזר בפלטפורמה והשוואתיות בין פרויקטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם את תוצרי סריקת הפראגמנטים עם ביולוגיה מבנית וכימיה רפואית לאופטימיזציה רציפה של מובילים (lead optimization).
- תומך ברציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי הבטחת שלמות הנתונים ויכולת מעקב.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות על קידום השלב הבא על ידי אספקת ראיות כמותיות חסונות למעורבות המטרה (target engagement).
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת סריקה אוטומטית זו המבוססת על NMR משולבת בממשק שבין תיקוף המטרה, זיהוי מובילים (lead identification) ומחקר פרה-קליני מוקדם, ומספקת יכולת הניתנת לשימוש חוזר הן עבור מטרות חלבון והן עבור מטרות RNA.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות והבהרה של מסלולים על ידי מדידה ישירה של קישור פרגמנטים למקרו-מולקולות ביולוגיות.
- סריקה: מספקת פלטי בדיקה סטנדרטיים, בעתירי-throughput וכמותיים לזיהוי אמין של "להיטים" (hits).
- אנליזה: מספקת פלטים סטטיסטיים חסונים, כולל שינויים ב-T2 relaxation וספי סף של chemical shift, להשוואת תנאי קישור.
- מחקר תרגומי: מבטיחה רציפות ואיכות נתונים עבור אופטימיזציה של מובילים (lead optimization) ומחקרי פרה-קליניקה בהמשך.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תזרים עבודה אוטומטי וניתן להרחבה, שניתן להתאים למספר יעדים ותוכניות גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזואי ומפחית את הסיכון המכניסטי בזיהוי פגיעות פרגמנטים (fragment hits).
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, את השחזוריות ואת התפוקה באמצעות אוטומציה וניתוח נתונים מתקדם.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מזעור התוצאות החיוביות והשליליות השגויות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של פגיעות פרגמנטים מאומתות על פני מחלקות מטרות מגוונות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בספקטרוסקופיית NMR, ניהול ספריות פרגמנטים וניתוח נתונים.
- מחייב גישה לרובוטים אוטומטיים להכנת דגימות ולמכשור NMR בעל תפוקה גבוהה.
- מצריך מבני נתונים סטנדרטיים ותיאום בין צוותים להשגת זרימות עבודה ניתנות לשחזור.
- התאמה למטרות חלבון ו-RNA דורשת אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור תנאי בופר, pH וליגנדים.
- התפוקה והיכולת להרחבה (scalability) תלויות בקיבולת החומרה ובאינטגרציית התוכנה.
