הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

הפרוטוקול שלנו מספק מידע חזותי ובזמן אמת על האופן שבו תהליך המורפוגנזה של העין מתרחש בתנאים נורמליים ופתולוגיים כאחד. הפרוטוקול שלנו מאפשר רכישה מהירה של z-stacks, מה שמקטין את משך הזמן בין כל תמונה תלת-ממדית במערך הנתונים. זה מספק רזולוציה טמפורלית מוגברת של האופן שבו מתרחשת מורפוגנזה עינית.

מיקום העובר בתוך הנימים יכול להיות מאתגר בשל צורתו הכדורית בשלב הסומייט הבודד, ולכן חשוב להעמיס מספר עוברים לתוך הנימים כדי להבטיח שלפחות אחד מהם נמצא בכיוון הנכון. כדי לסנן את נוכחותם של סומיטים במשך 10 שעות לאחר ההפריה, הניחו את העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאו והשתמשו במתאם פלואורסצנטי כדי לאשר את נוכחותו של טרנסגן rx3:GFP. לאחר שזוהו שלושה עד חמישה עוברי סומיט יחיד חיוביים ל-GFP, השתמשו במלקחיים עדינים כדי לפענח את העוברים.

כדי להטמיע את העוברים באגרוז, העבירו את העוברים לצינור מיקרוצנטריפוג המכיל 500 מיקרוליטרים של מאגר עוברי E3 בתוספת 168 מיקרוגרם למיליליטר של טריקאין והוסיפו 500 מיקרוליטרים של אגרוז טמפרטורת התכה נמוכה אך נוזלית של 2% ובופרת E3 לצינור עם ערבוב עדין. השתמשו בנימי זכוכית במילימטר אחד עם בוכנה PTFE כדי למשוך את העוברים המוטבעים באגרוז לתוך הנימים ולתת לאגרוז להתמצק למשך 30 עד 60 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מכניסים את הנימים לתוך של חיץ E3 עם תוספת טריקאין.

כדי להגדיר מיקרוסקופ יריעת אור להדמיית עוברים, מניחים את הנימים במחזיק הדגימה הנימי ולוחצים על נדן המתכת במרכז דיסקת המתכת של המחזיק. מניחים שני פקקי גומי לתוך הנדן כאשר החריצים פונים לקצות הנדן ומחליקים את הנימים דרך אמצע פקקי הגומי. ברגע שהסמן נמצא בבסיס נדן המתכת, השתמשו במכסה המתכת כדי לאבטח את הנימים במקומם והניחו את המחזיק בחלק העליון של המיקרוסקופ כשהסימנים הלבנים מיושרים.

סגור את המכסה של מחזיק הדגימה ולחץ על כפתור איתור נימי בממשק התוכנה של המיקרוסקופ. באמצעות לוח הבקרה של Ergo Drive, הזיזו את הנימים עד ממש מעל המטרה. לאחר פתיחת המכסה, דחפו בעדינות את הבוכנה עד שמקטע האגרוז המכיל את העובר תלוי מתחת לתחתית הנימית מול המטרה.

כבה את איתור נימים ולחץ על אתר דגימה כדי להעביר את התצוגה ממצלמת האינטרנט של תא הדגימה למטרת המיקרוסקופ והשתמש בתצוגה זו כדי להתאים את מיקום הדגימה בצורה מדויקת יותר. לאחר מכן כבה את דוגמת האיתור ועבור לכרטיסיית הרכישה. סמן את תיבות z-stack וסדרות הזמן.

בחלון הפרמטרים של מצב הרכישה, בחר את הגדרת יריעת האור הצדדית הכפולה וסמן את התיבות עבור היתוך צד דו-צדדי מקוון וסריקת צירים. לחץ על רציף כדי לקבל תצוגה חיה של העובר. בחלון הערוץ, בחר ערוץ 488 והגדר את עוצמת הלייזר לאחד ואת זמן החשיפה ל-7.5 אלפיות השנייה.

השתמש בלוח הבקרה של Ergo Drive כדי להתאים את מיקום העובר עד ששדה העין פונה ישירות למצלמה ומתאים את יריעות האור השמאלי והימני בפרמטרים של הערוצים עד ששדה העין יהיה בפוקוס מספיק. הגדר את מיקומי z הראשונים והאחרונים סביב 500 מיקרומטרים מעבר לאות הפלואורסצנטי האחרון הניתן לזיהוי ולחץ על אופטימלי כדי להגדיר את גודל הצעד ל- 0.477 מיקרומטר. כדי להגדיר את פרמטרי הדגירה, סמן את התיבה עבור יחידת פלטייה כדי לשמור על הטמפרטורה ב 28 מעלות צלזיוס.

בחלון סדרת הזמן, בחר את התדירות הניסויית המתאימה ואת מרווח הזמן כדי להשיג את התמונות. לחץ על התחל ניסוי. בחר את התיקיה לשמירת ערכת התמונות והגדר את קידומת התמונה ולאחר מכן לחץ על שמור כדי להתחיל את ההדמיה.

לניתוח תמונות, ייבא את קבצי התמונה לתוכנת ניתוח תמונות 4D מתאימה ולחץ על קוביית מציג 4D, סרגל קנה המידה וסמל הווידאו כדי לפתוח את שורת המשימות של לוח התכנון. בחר הוסף רצף מסגרת מרכזית וציין את משך הסרטון בשניות. בטל את סימון תיבת הסיבוב של היצירה וסמן את התקדמות הזמן כדי לכלול נקודות זמן ספציפיות בסרטון.

שמור את לוח התכנון כדי להחיל את אותם פרמטרים על ערכות תמונות מרובות. לחץ על ייצוא סרט כדי לשמור סרטון של הדמיית חלוף הזמן וציין את הגדרות ייצוא הסרט, כולל שם הקובץ והמיקום, פורמט הווידאו, רזולוציית הווידאו, קצב הפריימים, רזולוציית הנתונים. הוסף חותמות זמן אם תרצה ובחר רשומה.

כדי ליצור סרטוני רוטציה בנקודות זמן ספציפיות, הוסף רצף של מסגרת מרכזית כפי שהודגם זה עתה, אך סמן את תיבת הסיבוב של יצירת ובטל את הסימון של תיבת התקדמות זמן השימוש. כדי לעבד תמונה ברזולוציה גבוהה בכל כיוון ובכל נקודת זמן בודדת, בחר את סמל המצלמה במציג 4D. כדי לבנות צינור לניתוח, בחר בקבוקון כדי לגשת ללוח הניתוח ופתח את תפריט פעולות הניתוח כדי לבחור את רצף הפעולות המעניינות.

לחץ על המשולש הכחול כדי להפעיל את הצינור. בסוף הריצה, לחץ על עמודות תכונה בחלון הקופץ כדי להציג רשימה של התכונות שיכולות לספק מידע על האובייקט המעניין, ולאחר מכן לחץ על ייצוא כדי לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. בניתוח מייצג זה, עובר rx3:GFP מהונדס צולם מנקודת התצפית הגבית כל חמש דקות משלב הסומייט האחד ועד 24 שעות לאחר ההפריה במשך 14 שעות בסך הכל.

כפי שנצפה, ביצוע הרצת צינור של התמונות שצולמו מניתוח זה הקל על יצירת מסכה של העין המתפתחת. שים לב שכאשר שדה העין מופרד לשתי שלפוחיות אופטיות, ניתן היה לראות אזור חיובי שלישי של rx3:GFP במוח הקדמי שתרם להיפותלמוס. מידע זה נצפה גם בנתוני הנפח וניתן להפרידו בקלות מנתוני השלפוחית האופטית מכיוון שהוא היה קטן בהרבה בנפחו מזה שנצפה עבור כל שלפוחית אופטית.

ניתן לעקוב אחר הליך זה באמצעות ניתוחים נוספים, לדוגמה, מעקב אחר תאים בודדים על פני מערך הנתונים של התמונה.