ניתוח דפוסי תנועתיות של סטנטור במהלך ואחרי התחדשות מנגנון הפה באמצעות מעקב אחר תאים

Stentor coeruleus משמש זה מכבר כאורגניזם מודל להבנת התחדשות חד-תאית. בעוד שציר הזמן להתחדשות מורפולוגית חזותית ידוע, ציר הזמן להתחדשות תפקודית נותר לא ידוע. בדיקה זו עוקבת אחר התנועתיות של אוכלוסיית המרכז העוברת התחדשות מסונכרנת כך שניתן לכמת את התאוששות תפקוד האובדן.

ניתן להתאים אותו לשימוש עם סוגי תאים אחרים. היעדר חותם מאובטח של תא ההדמיה יגרום לדליפת בארות זו לתוך זו או להיווצרות בועות אוויר בתוך הבארות. עבור חוקרים שאינם מכירים את השימוש במרווחי סיליקון אנו ממליצים בחום להכניס PSW או מדיום נקי אחר לתוך כל אחת מהבארות כדי לבדוק אם יש דליפה לפני השימוש.

בניית תאי המדגם קלה יותר להצגה מאשר לתיאור מילולי. וכך גם התהליך לחילוץ דפוסי תנועתיות מנתוני הווידאו שנרכשו. כדי להתחיל, חותכים חתיכה של יריעת ספייסר סיליקון בעובי 250 מיקרומטר מעט קטנה יותר הן בגובה והן ברוחב מאשר שקופית מיקרוסקופ.

השתמש באגרוף שלם כדי ליצור בארות עגולות המשאירות מספיק מקום בין בארות שכנות כדי להבטיח אטימה טובה. ליזום התחדשות של מנגנון הפה על ידי דגירה של תאי stentor coeruleus ב 10% סוכרוז או 2% אוריה במשך שתי דקות. לאחר מכן יש לשטוף שלוש פעמים עם מדיום טרי.

בעדינות פיפטה כ 10 stentor לתוך כל באר. הקפדה על התאמת נפח הדגימה לנפח הבאר קרוב ככל האפשר. סגרו את הבארות על ידי הנמכה עדינה של פיסת זכוכית כיסוי מעל הבארות החל מקצה אחד.

השתמש באובייקט צר ומעט גמיש, כגון קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי ללחוץ על זכוכית הכיסוי במקום שבו הוא יוצר קשר עם יריעת הסיליקון כדי להבטיח אטימה טובה. מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ ומניחים את המיקרוסקופ להגדלה הנמוכה ביותר הזמינה כך שאחד מהם יתאים היטב למסגרת. התחילו את קיטועי הזמן ורכשו סרטון של עשר שניות בקצב של 30 פריימים לשנייה מכל באר בכל נקודת זמן.

כדי לכייל, קבל תמונה ברורה של שקופית כיול או סרגל ברור באותן הגדרות הגדלה כמו הסרטונים. באמצעות כל תוכנית צפייה בתמונות, ספרו את מספר הפיקסלים בין סימנים של מרחק פיזי ידוע. הורד את שני הסקריפטים, תאי המעקב והמעקבות הנקיים למיקום קל לזכירה במחשב והעבר את סרטוני הנתונים גם למחשב זה.

ארגן את סרטוני הנתונים בתיקיות. אחד לכל נקודת זמן. השתמש בתאי המסלול של Script כדי לבצע מעקב אוטומטי אחר תאים בסרטוני הנתונים על-ידי פתיחת תאי רצועה והפעלת הסקריפט בחר הוסף לנתיב "אם תתבקש על-ידי חלון קופץ אשר בדרך כלל יקרה רק כאשר הסקריפט מופעל בפעם הראשונה מתיקייה נתונה.

כשתתבקש, בחר סרטון נתונים אחד או יותר כדי להתחיל במעקב. נווט אל סרטוני הנתונים ולאחר שהיית מרוצה מרשימת הקבצים לחץ על open"כדי לדחות באופן ידני עקבות חריגים או כוזבים, פתח עקבות נקיים בחלון עורך MATLAB על ידי לחיצה כפולה על הקובץ. בבקשת הבקשה בחר פלט תיקיית נתונים לפי תאי מעקב.

נווט אל אחת התיקיות שנוצרו ובחר אותה. כשתתבקש, הזן אחד כדי לשמור על המעקב ואפס כדי לדחות את המעקב. לאחר מכן לחץ על Enter כדי לעבור לעקבה הבאה.

התחל על ידי הורדת התסריט שכותרתו עלילות ספגטי. פתח והפעל את הסקריפט. כאשר חלון דפדפן הקבצים צץ עם הבקשה, בחר תיקיה לפתיחה.

נווט אל התיקיה של אחת מנקודות הזמן. כאשר מתבקש, כיול, מהו מספר הפיקסלים למילימטר? הקלד את ערך הכיול והקש Enter.

התאם את צירי העלילה לפי הצורך על ידי שינוי שורה 55 של הסקריפט, אשר כברירת מחדל מוגדר ל- RR שווה לארבעה. עבור הכללת רדיוס של עד ארבעה מילימטרים. שמור את העלילה.

התוצאות מראות את התנועתיות הקולקטיבית של אוכלוסיית תאי הסטנטור בשעתיים, שלוש, שבע ושמונה שעות לתוך תהליך התחדשות המנגנון האוראלי. חלקות אלה מראות הן את הגידול הצפוי במספר הפרטים תנועתיים והן את הגידול הגדול פי ארבעה בטווח התאים תנועתיים ביותר באוכלוסייה. תאי השחייה המהירים ביותר, אם הם מתחילים קרוב לקצה, מוגבלים משחייה לחלוטין בקו ישר וטווח התנועה שלהם נראה קטן יותר.

תאי המערכת סווגו לשלוש קטגוריות נפרדות, לא תנועתיים ללא אחיזה נראית לעין במהירות, לא תנועתיים עם אחיזה נראית מהר, ותנועתית. התוצאה הראתה היסטוגרמה מוערמת המסכמת את ספירת התאים היחסית בקטגוריות אלה כפונקציה שלנו להתחדשות. בתקופות מאוחרות יותר, מספר משמעותי של תאים נמצאו במושבות עם צום אחיזה נראה לעין, מה שמרמז מאוד על כך שהם חקרו את הסביבה והתחברו באופן מועדף ליד אחרים מסוגם.

חשוב לבחור את מידות הבאר לדוגמה שעובדות היטב עבור stentor coeruleus שגודלם כמילימטר אחד. זה כולל עובי ספייסר סיליקון בקוטר 5/16 אינץ', ו-10 תאים לכל באר. יש להתאים מספרים אלה בעת התאמת פרוטוקול זה לסוגי תאים אחרים.

ניתן לבצע בדיקה זו בשילוב עם RNA-I כדי לחקור ולהשוות את ההתחדשות של פנוטיפים שונים של סטנטור.