הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג'ל מבוסס agarose Microfluidic
11 בפברואר 2008
אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.
שלום, אני קווין וון. אני סטודנט לתואר שני בהנדסה במעבדת הביו-נוזלים (Biofluids Lab) באוניברסיטת קורנל. והיום אני אדבר על שימוש במכשיר מיקרופלואידי מבוסס agarose כדי לחקור את השפעת EGF (גורם גדילה אפידרמלי) על תאי גזע עצביים של עכברים.
המכשיר מורכב בעיקרו משלושה תעלים מיקרופלואידיים, שכל אחד מהם ברוחב 150 מיקרון. ה-EGF מופעל באמצעות משאבה אל אחד התעלים הצדדיים והבופר מופעל אל התעל הצדדי השני. תצורה זו יוצרת למעשה מדרג כימי ליניארי סטטי לרוחב התעל המרכזי.
מאחר ש-EGF מדליף בקלות דרך ג'ל האגרו, תאי גזע עצביים נזרעים בתעלת המרכז ומהלך נדידתם מנוטר באמצעות מיקרוסקופ. לפיכך, המכשירים מורכבים בעיקר משכבת פלקסיגלאס עליונה הכוללת את כל פתחי הכניסה והיציאה לחיבור לפביות. מתחתיה נמצאת ממברנת ג'ל אגרו, שבה מוטמעים ארבעה מכשירים תבניתיים.
זה מוקף במפריד PDMS, המבטיח עובי קבוע לאורך כל המכשיר. ה-PDMS והג'ל מורכבים על משטח זכוכית, המצופה ב-ect. דבר זה מסייע לתאים להיצמד למשטח הזכוכית.
בנוסף, פלטת הפלדה הנירוסטה משמשת להרכבת המכשיר כולו, ואנו מהדקים את המכשיר יחד באמצעות ברגים. שורת התאים מסוג הפרא (wild type) עברה טרנספקציה עם וקטור רטרו-ויראלי לביטוי 과י (overexpression) של קולטן EGF מסוג הפרא, ושורת תאי הדלתה עברה טרנספקציה עם גרסה מוטציה של קולטן EGF המאפשרת לו להיות פעיל באופן קבוע ללא ליגנד EGF. אשמח להתחיל בהסבר על תהליך ההרכבה של המכשיר המיקרו-פלואידי שלנו.
ראשית, הצבתי את מחסום ה-PDMS מסביב למבני התבליט של מיקרו-התעלות הסיליקון בתבניות שלנו. כעת, אשקול 0.3 גרם של agros. לאחר מכן, אעלה 10 מיליליטר של מצע גידול שאינו תלוי CO2 ואוסיף אותו ל-agros.
אני אבצע פיפטאזה למעלה ולמטה כדי לערבב את אבקת ה-agros עם המצע שאינו תלוי CO2. כעת אנו מוכנים למיקרוגל. כפי שניתן לראות כעת, ה-agros נוזלי, אך נותרו מספר גרגירים.
אנסה לסובב את המבחנה כדי להמיס את הגרגיר ולהיפטר מבועות האוויר. כעת אני שופכת את ה-agarose הנוזלי עלून אלמנטי התבליט של תבנית הסיליקון, ואקח זכוכית כיסויה סטרילית ואניח אותה מעל למרווח ה-PDMS. אני מניחה אותה בזווית כדי לנסות לדחוף החוצה את מרבית בועות האוויר מה-agarose gel.
הפעלתי לחץ ואמשיך להפעיל לחץ עד שמעטפת ה-agros תתמצק. לאחר דקה עד שתי דקות היא התמצקה. כעת אסיר את עודפי ה-agros מהסלייד.
השלב הבא הוא להחליק בעדינות החוצה את תיתור הזכוכית, וניתן להשליך תיתור זכוכית זה. כעת אנסה להעביר בעדינות את תבנית ה-agros לתיתור זכוכית שציפיתי מראש ב-fibronectin. אני משתמש בגיליון פלסטיק סטרילי זה כדי לסייע לי להרים את תבנית ה-agros יחד עם מחסור ה-PDMM MS, ואעביר את תבנית ה-agros כאשר התעלות פונות כלפי מטה לעבר התיתור.
כעת, לאחר שהמכשיר מקובע להטיה, אנקב חורים במאגרים הבודדים כדי שהסבב הפלסטי יוכל לגשת לתעלות. אבצע זאת באמצעות מחורר מתכת קטן. כעת סיימנו לנקב חורים במכשיר.
אוסיף 500 µL של מצע שאינו תלוי CO2 כדי למנוע התייבשות של המיקרו-ערוצים, ואקפיד להמתין אחת עד שתי דקות. כעת, לאחר אחת עד שתי דקות, אנסה לנקז את עודפי המצע ולאחר מכן איישר את החורים שננקבו בתבנית האגרס עם חורי הכניסה והיציאה של סעפת הפלקסיגלאס. לאחר שהחורים הגיעו ליישור, אלחץ בחוזקה כדי ליצור אטימה טובה.
כעת אני מניח את המניפולטור מהפלקסיגלאס מעל התושבתות מפלדת אלחלד, ואסגור בעדינות את המכשיר באמצעות ברגים. אני נזהר מאוד שלא להדק את הברגים יתר על המידה, שכן הדבר ימעך את התעלים, ואני מחזיר את הברגים בסדר עם השעון כדי למנוע את תזוזתו של ג'ל ה-Agarose הפנימי. אני אשאב 1 mL של מדיום ואשתמש במזרק זה כדי לבחון את המכשיר.
וכפי שניתן לראות, אני מזריק נוזל לכל מיקרו-תעלה ובודק אם נוזל יוצא מכל פתח יציאה. נכון לעכשיו, הנחתי את המכשיר המורכב בתא הסביבתי של המיקרוסקופ. תא זה נשמר בטמפרטורה של 37 °C, כך שהמכשיר יתחמם ויהיה מוכן לשלב זריעת התאים.
וכפי שניתן לראות, כבר השחלתי את שני צינורות משאבת הפריסטלטיקה דרך המערך. כעת אני שוטפת את הצינורות עם PBS כהכנה לניסויים שלנו. עכשיו נבצע את הגדרת הצינורות.
אני אשחיל את צינורות משאבת ה-parasol דרך הפקקים שבהם כבר נקבו חורים. לכל צינור יש מספר ספציפי של חריצים, כדי שאוכל לזהות הן את הכניסה והן את היציאה של הצינור. לפיכך, הצינור עם ארבעה חריצים יקבל את ה-10 nanogram per mil.
כעת נחבר את הפיתולים של תמיסת ה-EGF למכשיר. אחבר אותם לכל מכשיר בהתאם למספר החריצים שבו, כך שיתאימו לכמות התמיסה שהמכשיר סופג.
וכעת אני מחבר את צינור היציאה. אנו משתמשים בצינור tigon שקוף כדי להבטיח שהמדיה אכן זורמת דרך צינור היציאה ושאין חסימות בתעלה. וכעת אני אפעיל את משאבות הפריסטלטיקה.
כעת אתחיל בהליך זריעת התאים בערוץ המרכזי. אתחיל בהוצאת עודפי המצע מערוץ החיישן. כעת אוכל לראות את התאים.
התאים כבר נמצאים בתרחיף במצע שאינו תלוי CO2. הזרקתי 60 מיקרוליטר בפתח הכניסה של התעלה המרכזית והזרקתי 20 µL בפתח היציאה. בתקווה שהתאים ישקעו באמצעות זרימה מונחית כבידה.
אחזור על הליך זה עבור שני הערוצים הרגישים האחרים, וכעת נבחן זאת תחת המיקרוסקופ כדי לראות אם השבצת התאים הצליחה. כעת התאים נצמדו לשקף הזכוכית ובתוך מספר דקות הם יתחילו להתפשט ולהשיג את המורפולוגיה הייחודית שלהם. היום כיסינו את הרכבת המכשיר עצמו, את הכנת הריאגנטים ואת טכניקות המיקרוסקופ שבהן אני משתמש כדי לדגום את נדידת התאים בתוך המכשיר.
לסיכום, אנו מקווים כי למכשיר זה יהיה יישום רחב הרבה יותר, ובמיוחד במסגרת קלינית. לכן, באיור 1, מוצגים בציר האופקי המסלולים של תאי C 17.2 ובציר האנכי ריכוזים עולים של EGF.
הוא מראה את מסלולי התנועה של זני התאים השונים של C 17.2 שבהם השתמשנו בניסויינו עם אותה ריכוז EGF. נתוני תאי האב מראים כי קיים שיא בניידות במדרג ריכוזי EGF של 10 nanogram per mil, מה שמעיד על כך שהקולטנים הגיעו לרוויה של ליגנד בריכוז EGF גבוה יותר. ונתוני הטיפוס הפראי מראים כי קיימת עלייה בניידות בריכוז של 100 nanogram per mil של EGF.
דבר זה מעיד על כך שהקולטנים אינם מגיעים לרוויה בריכוזי EGF גבוהים יותר. זאת מכיוון שהם תוכננו כדי לבטא באופן יתר את קולטן ה-EGF. לבסוף, הנתונים של קו התאים דלתא מעידים כי ניידות התאים היא בקירוב בלתי תלויה בריכוז ה-EGF.
דבר זה צפוי, כיוון שקולטני ה-EGF המוטגים תוכננו להיות מופעלים ללא תלות בנוכחות EGF.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים כי ביטוי יתר של קולטני גורם גדילה אפידרמליים (EGFR) מגביר את הניידות של תאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות התקן מיקרופלואידי חדש המבוסס על ג'ל אגרוז. טכנולוגיה זו ניתנת להתאמה למערכות תאים יונקיים אחרות שבהן מקורות התאים מוגבלים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
רקע
- גורם הגדילה האפידרמלי (EGF) משפיע על התנהגות תאים.
- תאי גזע עצביים (NSCs) חיוניים עבור התחדשות עצבית.
- התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים בקרה מדויקת על סביבות תאיות.
- הבנת הניידות של תאי גזע עצביים (NSC) יכולה לסייע ברפואה רגנרטיבית.
מטרת המחקר
- לבדיקת השפעת EGF על ניידות של NSC.
- לפיתוח התקן מיקרופלואידי לחקר תגובות תאיות.
- לספק תובנות לגבי התנהגות של NSC בסביבה מבוקרת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח של התקן מיקרופלואידי מבוסס ג'ל אגרוז.
- יצירה של מדרג כימי ליניארי סטטי של EGF.
- תצפית על ניידות של NSC בתגובה לחשיפה ל-EGF.
- שימוש בערוצים מיקרופלואידיים לבקרה מדויקת של נוזלים.
תוצאות עיקריות
- ביטוי יתר של EGFR מגביר משמעותית את ניידות תאי ה-NSC.
- ההתקן המיקרופלואידי יוצר מדרגי ריכוז כימיים ביעילות.
- התוצאות מצביעות על יישומים פוטנציאליים בטיפולים רגנרטיביים.
- ניתן להתאים את הממצאים לתאי גזע עצביים אנושיים.
מסקנות
- EGF ממלא תפקיד קריטי בניידות של NSC.
- המכשיר שפותח הוא כלי בעל ערך למחקרים תאיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתרחב לסוגי תאים ולתנאים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניידות של תאי גזע עצביים משמשת כביו-סמן ניבוי לפוטנציאל טומוריגני ולהפרעות התפתחותיות, מה שהופך את הערכתם הכמותית לקריטית בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות (target validation). פלטפורמה מיקרופלואידית המבוססת על ג'ל אגרוז מאפשרת ביצוע בדיקות ניידות הניתנות לשחזור ובשליטה במדרוג (gradient), התומכות בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מודולטורים של נתיב ה-EGFR. גישה זו מגבירה את הביטחון בזיהוי מובילים (leads) על ידי קישור בין ביטוי יתר של קולטן לתוצאות פנוטיפיות תפקודיות במערכת רלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ניידות תלוית EGFR כמדד תפקודי למעורבות המטרה בתאי גזע עצביים.
- ערך תפעולי: מספק מיקרו-סביבה מבוקרת לבידוד השפעות האיתות של EGFR ממשתנים מתערבים במבחני ניידות.
- ערך חיזוי: תומך בסינון פנוטיפי של מודולטורים של EGFR על ידי כימות שינויים בניידות תחת מדרגי ריכוז כימיים מוגדרים.
סקר ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת מדידות כמותיות ואופטיות של ניידות, המתאימות לניתוח עתיר-תוכן (high-content analysis) ולסריקת תרכובות.
- שחזוריות: ייצור ג'ל אגרוז מבטיח גיאומטריה עקבית של התעלות ותכונות דיפוזיה דומות בין חזרות.
- סקביליות: תבנית של מספר התקנים בממברנת ג'ל אחת מאפשרת בדיקה מקבילה של מספר תנאים או שורות תאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: קושר את ניידות תאי NSC להערכת גורמים תומאי גידול, ובכך תומך במודלים פרה-קליניים של פלישת תאי גזע של סרטן המוח.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהיר האם ביטוי יתר של EGFR מניע ניידות ללא תלות בליגנד, ובכך מסייע בבחירת מטרה לאסטרטגיות עיכוב.
- המשכיות תרגומית: מאפשר השוואה בין וריאנטים של EGFR מסוג wild-type, כאלה עם ביטוי יתר, ווריאנטים פעילים באופן קוסטטיטיבי, כדי לחזות פרופילים של תגובה קלינית.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
המכשיר משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לאופטימיזציה של מובילים, ומספק נתונים פנוטיפיים מבוססי ניידות המשמשים לקבלת החלטות המשך/עצירה (go/no-go) לפני השקעה בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבחינת השערות לגבי תפקידו של EGFR בניידות של NSC באמצעות בקרה מדויקת של מפל (gradient) ודימוי בזמן אמת.
- סריקה: מספק פלטי ניידות כמותיים וסטנדרטיים המאפשרים השוואה בין תרכובות המווסתות את EGFR או בין וריאנטים גנטיים.
- אנליטיקה: מייצר מדדים מבוססי מסלול (trajectory) המקלים על השוואה סטטיסטית של הניידות בין תנאים וקווי תאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי ניידות in vitro לרלוונטיות פתופיזיולוגית במודלים של התפתחות עצבית וסרטן המוח.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמת ג'ל האגרוז ניתנת להתאמה לסוגי תאי יונקים אחרים, ובכך תומכת בסטנדרטיזציה בין פרויקטים שונים בבדיקות מבוססות ניידות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באיתות של EGFR על ידי קישור מצב הרצפטור לפנוטיפים תפקודיים של ניידות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור של הבדיקה באמצעות ייצור ג'ל סטנדרטי ויצירת גרדיאנט באמצעות פרפוזיה בערוץ צדדי.
- ערך אסטרטגי: משפר את תיעדוף המטרה על ידי אספקת תיקוף תפקודי מעבר לבדיקות קישור או ביטוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם-סיכון של מועמדים המכוונים ל-EGFR בהתבסס על הפחתת סיכונים פנוטיפית מונעת-ניידות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבה מיקרופלואידית, טיפול בג'ל אגרוז ודימוי תאים חיים תחת פרפוזיה מבוקרת.
- תלוי בגישה למשאבות פרפוזיה, תאי סביבה ומיקרוסקופים הפוכים למעקב אחרי ניידות בשיטת time-lapse.
- מחייב סטנדרטיזציה של צפיפות זריעת התאים ועובי הג'ל כדי להבטיח מדרגי דיפוזיה והיצמדות הניתנים לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה עבור סוגי תאים שונים בהתבסס על תכונות ההיצמדות ומאפייני הניידות על משטחים מצופים בפיברונקטין.
- מוגבל על ידי הנגישות האופטית של מטריצת הג'ל ואוטופלואורסצנציה פוטנציאלית המשפיעה על קריאות מסוימות המבוססות על פלואורסצנציה.
