הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים
6 בנובמבר 2021
טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.
היום, אנו להדגים שיטה כדי לסנן ספריית פפטיד, נגד קולטן מאסטר שהתגלה לאחרונה, שהוא קולטן חלבון G הקשורים Mas X2, הידוע גם בשם קולטן MRGPRX2. תאי התורן הם חלק בלתי נפרד ממערכת החיסון, והם ממלאים תפקיד מכריע הן בתגובות חיסוניות מולדות והן בתגובות חיסוניות אדפטיביות. תאי פיסט מופעלים על ידי קולטן Fc אפסילון R1 הקשור לאנטיגן, או על ידי קולטן X2 שהתגלה לאחרונה.
הפעלה של קולטן X2 כבול פני השטח, נקשרה למספר מחלות אימונולוגיות ודלקתיות ולכן חשוב להבין את המנגנון המחייב של קולטן זה לליגנדים שלו. כדי לעשות זאת, פיתחנו ספרייה של מולקולות פפטיד קטנות, והקרננו אותן כנגד קולטני X2 המובעים יתר על המידה על hexis. במחקר, ספריית פפטיד נבנתה בטכניקות פשוטות ורב-תכליתיות של סריקת אלנין, וחתכים בחומצות אמינו.
Heck293 אומר, ביטוי קולטני X2 כאשר מופעל עם פפטידים ו hexis רחב סוג שימשו שליטה. בשחרור truncation בעת ההפעלה היה מנוטר כדי ללמוד את ההפעלה מבוססת X2. באופן ניסיוני, צבע רגיש לסידן Fura-2 AM מתרגש ב-340 ו-380 ננומטר, בעוד הפליטה נרשמת ב-510 ננומטר.
לאחר כריכת סידן, עוצמת הפלואורסצנטיות ב 340 עולה, בעוד זה של 380 ננומטר, פוחתת. הצבע מופקד לאחר מכן ביחס של עוצמת הפלואורסצנטיות ב 340, לזה של 380 ננומטר. 340 של יחס 380, הוא פרופורציונלי לסידן תאי, הערך של זה, ניתן לחשב, על ידי משוואת Grynkiewicz.
יחס הטאבינג של שתי עוצמות פלואורסצנטיות, השפעה של גורמים ניסיוניים כמו דילול, ליבון תמונות, דליפת צבע וצפיפות ריח מזוהים. אז, ללא דיחוי נוסף, בואו נתחיל את הניסוי. כדי לזהות את הליבנדות של קולטן MRGPR X2 של תא התורן, גנרטור N-קטוע, C-חתוך, וספריית הפפטידים N+C-קטוע, על-ידי חיתוך N-terminal, C-terminal וחומצות האמינו N+C-terminal של חוסר פרודוקטיביות של pam-12.
השתמש סינתזת פפטיד שלב מוצק לסנתז את הפפטידים. שנה את מסוף הסיום לקבוצת גאות ושפל מוגדרת, ואת C-terminal כדי לעמוד בפני קבוצה. ליצור ואלנינים יכול ספריית פפטיד, על ידי החלפת חומצות האמינו בהתאמה של pam-12 על ידי אלנין, אחד בכל פעם.
שנה את מסוף הסיום לקבוצת setide ואת C-terminal לקבוצה אמידים. הכן את המדיום של תרבית על ידי שכשהם DMEM גלוקוז גבוה, עם סרום בקר עוברי 10%, שני מילימולר L-גלוטמין, מאה יחידות לליטר של פניצילין, ומאה מיקרוגרם, לכל מ"ל של סטרפטומיצין. מלבד התאים בתרבית tee sue, 375 בקבוקון תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2, עד שהם 75 עד 80% במפגש.
פעם 75%confluent, לשטוף את התאים ולהוסיף שניים עד שלושה מ"ל של Proof-C, כדי לנתק את התאים. לאחר שהתאים נותקו, אספו את התאים ב-Proof-C. מוסיפים בין 6 ל-9 מ"ל בינוני טרי.
צנטריפוגות התאים ב 1620 גרם במשך שלוש עד חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant כדי לאסוף את הכדור. resuspend התאים במדיום תרבית טרי.
לדלל את התאים, לפי הריכוז הרצוי. ב 200 microliters של השעיית התא עם ריכוז של 200, 000 תאים, לשפוך את האמבון בכל באר לחפש 40, 000 תאים לבאר. שמור על התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור.
השתמש בצבע Fura-2 AM לניסוי. הוסף 50 מיקרוליטר DMSO ב 50 מיקרוגרם Fura-2 AM, כדי להכין פתרון סטארק מילימולרי אחד של צבע Fura-2 AM. הוסף מיקרוליטר אחד של צבע Fura-2 AM מילימולרי אחד לכל מ"ל של מדיום טרי כדי להכין את המדיום המדולל של ריכוז צבע מיקרומולרי אחד.
מוציאים את הצלחת 96-well מן האינקובטור להשליך את המדיום. החליפו את המדיום במדיום דילול טרי. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מדיום דילול בכל באר.
לדגור על התאים במשך 30-40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור. בזמן שהתאים דוגרים, קבעו את קורא הלוחות. הגדר את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס.
בהגדרות, בחר Flex. הגדר את מצב הקריאה לפלורסצנטיות ולקרואה תחתונה. באורכי גל, הגדר את מספר אורכי הגל לשניים.
הגדר את העירור ל 340 ננומטר ו 380 ננומטר. הגדר את הפליטה ל 510 ננומטר. השאר את הרגישות לברירת מחדל.
בתזמון, הגדר את מרווח הזמן ל- 3.9 שניות. הגדר את זמן הריצה ל- 94 שניות כדי לקבל 25 מספרי קריאות. לאחר מכן, בחר את סוג לוחית ה- Assay.
לאחר מכן, בחר את הבאות לקריאה. ב-Compound Transfer, הגדר העברות לאחת, ואת נפח התחלתי למאה מיקרוליטרים. הגדר גובה פיפטה למאה מיקרוליטרים, נפח ל-50 מיקרוליטרים, ואת Time Point ל-36 שניות כדי להוסיף את התרכובת, ולטפל בקריאה.
לאחר מכן, בחר את סוג לוחית המקור המורכב. השאר Triturate לא בשימוש. בחר את הפריסה עצות ועצות Pipette.
עבור עמודות מורכבות ותן טיפים, המתחם יועבר בעמודה אחת מהצלחת המורכבת. הגדר את עמודת העצות לעמודה אחת ואת העמודה המורכבת לעמודה אחת. השאר את כיול אוטומטי ב- On.לחץ על אישור. לאחר 40 דקות של דגירה, להסיר את המדיום.
לשטוף את התאים עם מאגר XDB. הוסף מאה מיקרוליטרים של מאגר XDB לקריאת פלואורסצנטיות. קח את הצלחת לקריאת פלואורסצנטיות.
כאשר פריצ'ט הגיע ל-37 מעלות צלזיוס, לחץ על תא הקריאה, כדי להכניס את צלחת ההסתה לקורא לוחות הפלואורסצנטיות. לחץ על המקור כדי לשים את הצלחת המורכבת. הכן את הצלחת המורכבת על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של יונומיסין פפטידים מכובדים ו- EGTA כדי להפוך פתרונות X.
לחץ על הקצה פראט כדי לשים את תיבת הקצה. השתמש בקצה שחור כדי למנוע פלואורסצנטיות טיפ. לאחר שהלוחות נשמרו, ואם אתה משתמש בהגדרות התוכנה ולחץ על קרא.
קבע את ריכוז הסידן מיחס הפלואורסצנטיות על ידי משוואת גרינקיביץ'. מוצג נתוני הפלואורסצנטיות של פפטיד טוב פאם. כפי שניתן לראות, לאחר תוספת פפטיד ב 36 שניות, פלואורסצנטיות ב 340 ננומטר כי הוא פושר עולה על ידי זה של 380 ננומטר שיא פוחתת.
הנתונים מיוצגים כיחס של 340, לזה של 380 אות. הם מראים את האותות עולה לאחר תוספת פפטיד. נתון זה הוא הנתונים הייצוגי להפעלת פפטיד.
איור A מראה את אותות הפלואורסצנטיות להפעלה של פפטיד. נתונים מייצגים תואמים cram12 פפטיד נוספה לאחר יצירת בסיס עבור מחזורי אמצעי תשלום, כפי שמוצג על ידי ado. איור B מראה את היחס בין פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-340 ננומטר, לזה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-380 ננומטר.
איור זה הוא הנתונים הייצוגי עבור הריק. איור א' מציג את אותות הפלואורסצנטיות עבור הריק. HTB נוספה לאחר דילול קו בסיס עבור 10 מחזורי הזנה כפי שמוצג על ידי ado.
איור B מראה את הקצבה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב 340 ננומטר לזה של פליטת פלורסנס לאחר עירור ב 380 ננומטר. נתון זה הוא הנתונים הייצוגיים עבור הסטנדרטים לכיול צבע. איור A מראה כי היונומיצין נוספה בקריאה העשירית, כפי שניתן לראות על ידי המהומה כדי לקבל פלואורסצנטיות מקסימלית במצב כבול במזומן.
EGPA Triton X מאה נוספה לאחר 20 קריאות כפי שמוצג על ידי ado שמקבלים אות מינימום. איור B מראה את היחס בין פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-340 ננומטר לזה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-380 ננומטר. ערכים אלה נמצאים עוד יותר במשוואת Grynkiewicz כדי לקבל את המטמון התאי של ריכוז.
איור זה מציג את האפיון של פפטיד נציג כדי לאשר את הרצף והטוהר. איור A מראה שהמסה האנכית של רצף הפפטיד הייצוגי WNK WAL הייתה 857.90 דילול צבע. אשר מוצג על ידי יחס N על Zed בספקטרוסקופיית מסה.
איור B מראה טוהר פפטיד של 99%, כפי שאושר על-ידי HPLC. פפטיד זה שייך לספריית הפפטידים של N+C. לסיכום, השיטה המתוארת כאן היא קלה ורב-תכליתית אשר יכולה להיות יעילה ובהירה להקרנה מבוססת סידן בקנה מידה אחרון.
עם זאת, ישנם מספר גורמים הקובעים את איכות הנתונים, ולכן, האיפור צריך להיות מותאם למערכת מכשירים סלולריים נתון. תודה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה חסכונית ואמינה לסריקת ספריות פפטידים כנגד הקולטן MRGPRX2 (Mas-related G protein-coupled receptor X2), רגולטור מרכזי של הפעלת תאי מאסט ותגובות חיסוניות. באמצעות שימוש בתאי HEK293 שהונדסו להביע MRGPRX2 ובבדיקת זרם סידן המבוססת על Fura-2, הפרוטוקול מאפשר זיהוי של ליגנדים ספציפיים לקולטן בתפוקה גבוהה, ובכך מתגבר על המגבלות הכרוכות בשימוש בתאי מאסט ראשוניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- פרמקולוגיה של רצפטורים
רקע
- MRGPRX2 הוא רספטור קריטי המעורב בתגובות חיסוניות המתווכות על ידי תאי מאסט, והוא קשור למחלות אימונולוגיות ודלקתיות שונות.
- זיהוי ליגנדים ספציפיים עבור MRGPRX2 חיוני לפיתוח טיפולי ולהבנת תפקוד הרספטור.
- תרביות מסורתיות של תאי מאסט הן יקרות ומאתגרות לתחזוקה לצורך סריקת ליגנדים בקנה מידה רחב.
- תאי HEK293 המבטאים MRGPRX2 מהווים חלופה מעשית לבדיקות in vitro.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של שיטה פשוטה וניתנת להרחבה לסריקת ספריות פפטידים נגד MRGPRX2.
- זיהוי ואפיון של ליגנדים פפטידיים המפעילים את MRGPRX2.
- סיוע בניתוח בסביבת תפוקה גבוהה של אינטראקציות ליגנד-רספטור הרלוונטיות לוויסות חיסוני.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בניית ספריות פפטידים באמצעות סריקת אלנין (alanine scanning) וקיטוע של הקצוות N- ו-C של הפפטיד PAMP-12.
- סינתזה של פפטידים באמצעות סינתזת פפטידים במוצק עם מודיפיקציות טרמינליות ספציפיות.
- תרבית של תאי HEK293 המבטאים באופן יציב את MRGPRX2 והכנתם לבדיקה בלוחות 96-בארים.
- טעינת תאים בצבע Fura-2 AM הרגיש לסידן ומדידת שטף סידן תוך-תאי בעקבות גירוי פפטידי באמצעות קורא לוחות פלואורסצנציה (עירור ב-340/380 nm, פליטה ב-510 nm).
- ניתוח נתונים באמצעות משוואת Grynkiewicz לכימות ריכוזי סידן תוך-תאיים.
- אפיון פפטידים באמצעות ספקטרומטריית מסות ו-HPLC לאישור הרצף ולהערכת הטוהר.
תוצאות עיקריות
- השיטה זיהתה בהצלחה הפעלה של MRGPRX2 על ידי פפטידים ספציפיים, כפי שהודגם בשינויים ביחסי הפלואורסצנציה של Fura-2.
- פפטידים מפעילים מייצגים הראו עלייה ביחסי הפלואורסצנציה ב-340/380 nm לאחר הוספתם, דבר המאשר את הפעלת הרצפטור.
- ביקורות בלנק וכיול תיקפו את הספציפיות והרגישות של הבדיקה.
- טוהר הרצף והפפטידים אושרו באמצעות ספקטרומטריית מסות ו-HPLC, כאשר פפטידים מייצגים הגיעו לרמת טוהר של 99%.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר מהווה גישה מהימנה, יעילה וחסכונית לסריקה רחבת היקף של ליגנדים פפטידיים המכוונים ל-MRGPRX2.
- תאי HEK293 המבטאים MRGPRX2, בשילוב עם בדיקות סידן מבוססות Fura-2, מספקים פלטפורמה חסונה לזיהוי תפקודי של ליגנדים.
- אופטימיזציה של תנאי הבדיקה נחוצה עבור מערכות תאים-מכשירים שונות כדי להבטיח את איכות הנתונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי בתפוקה גבוהה של ליגנדים פפטידיים עבור MRGPRX2 הוא קריטי לקידום טיפולים במודולציה חיסונית ולהפחתת סיכונים בתיקי גילוי מוקדמים. השימוש בתאי HEK293 מהונדסים המבטאים MRGPRX2 מאפשר סריקה ניתנת לשחזור ובקנה מידה רחב, המתגברת על המגבלות של מערכות תאי מאסט ראשוניים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בתיקוף המטרה ומספקת מידע לפיתוח בדיקות המשך עבור גילוי תרופות לקולטנים חיסוניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה שיטתית של ספציפיות הליגנדים של MRGPRX2 באמצעות מודלים תאיים מהונדסים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד אינטראקציות רספטור-ליגנד במערכת מבוקרת.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות קריאות כמותיות של זרמי סידן.
- מספק פלטפורמה למיון פורטפוליו המבוסס על פרופילי פעילות של ליגנדים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת בדיקות מבוססות תאים מהומקות וניתנות להרחבה לסריקת ספריות פפטידים.
- מבצע סטנדרטיזציה של מדידה כמותית של הפעלת רצפטורים באמצעות יחסי פלואורסצנציה של Fura-2.
- מאפשר תהליכי עבודה בעלי סבירות לשחזור ובתפוקה גבוהה, המתאימים להערכת תרכובות.
- תומך בהעברתיות של בדיקות ובשימוש חוזר בפלטפורמה בין צוותי מחקר ופיתוח.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את זיהוי הליגנדים למסלולים חיסוניים רלוונטיים למחלה המנוהלים על ידי MRGPRX2.
- מספק רצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אישור פעילות הליגנד במערכות מהונדסות.
- מפחית את הסיכון הטרנסלציוני (translational risk) על ידי מתן אפשרות לאפיון תפקודי מוקדם של פפטידים מועמדים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת סריקה זו מציבה את בדיקות ה-HEK293-MRGPRX2 ההנדסיות בממשק שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), ובכך היא תומכת הן בתיקוף מטרות מונחה-השערות והן בסריקת תרכובות ניתנת להרחבה.
- ביולוגיה של גילוי: בדיקות כמותיות של שטף סידן מבהירות את מנגנוני הפעלת הרצפטור ותומכות בהפחתת סיכונים ביולוגיים.
- סריקה: קריאות בעלות תפוקה גבוהה וניתנות לשחזור מאפשרות השוואה איתנה בין וריאנטים של פפטידים לבקרות.
- אנליטיקה: מדידות יחס פלואורסצנציה ותוצרי משוואת Grynkiewicz מספקים נתונים כמותיים וסטנדרטיים לצורך קבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: זיהוי ליגנדים פונקציונליים מנחה את הבחירה במודלים של מחלות וסנכרון של סממנים ביולוגיים בשלבים הבאים.
- שימוש חוזר ארגוני: הפלטפורמה ניתנת להתאמה למטרות GPCR אחרות, ותומכת בצרכים רחבים יותר של סריקת פורטפוליו.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי אינטראקציות בין מטרה לליגנד ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מייעל את הסטנדרטיזציה של הבדיקה, את השחזוריות ואת יכולת ההרחבה לסריקת פפטידים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לתיקוף פונקציונלי מוקדם וחסון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים למודולציה חיסונית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהנדסת תאים, סינתזת פפטידים ותכנון בדיקות המבוססות על פלואורסצנציה.
- נחושה גישה לקוראי לוחות פלואורסצנציה ותשתית אנליטית למדידות כמותיות של סידן.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי הבדיקה ושל פרוטוקולי ניתוח הנתונים.
- עשוי לדרוש התאמה של פרמטרי הבדיקה עבור שורות תאים שונות או מטרות רספטוריות שונות.
- איכות הנתונים תלויה באופטימיזציה של טעינת הצבע, צפיפות התאים וצמצום ארטיפקטים כגון פוטובליצ'ינג.
