מערך Optrode לאפנון אופטוגנטי סימולטני והקלטה עצבית חשמלית
1 בספטמבר 2022
כאן אנו מציגים את שיטת הייצור של מערכת אופטרודה עם סיבים אופטיים להעברת אור ומערך אלקטרודות להקלטה עצבית. ניסויי In vivo עם עכברים מהונדסים המבטאים את channelrhodopsin-2 מראים את ההיתכנות של המערכת לגירוי אופטוגנטי סימולטני ורישום אלקטרופיזיולוגי.
פרוטוקול זה כולל ייצור של מערכת optrode עבור גירוי אופטוגנטי סימולטני והקלטה אלקטרופיזיולוגית. המערכת המוצעת מבוססת LED משפרת את יעילות צימוד האור באמצעות מערך מיקרולנס. למקור אור LED יש תאורה פשוטה המוגדרת מאשר מקור אור לייזר, כך שהמערכת ישימה בקלות למערכת האלחוטית.
אופטוגנטיקה היא טכניקת נתיב להבנת הפתולוגיה של מחלות נוירולוגיות ומנגנוני טיפול. ניתן ליישם אופטוגנטיקה לטיפול בפגיעה בחוט השדרה, אפילפסיה, מחלת פרקינסון ומחלת אלצהיימר. ניתן ליישם את ההתקן מבוסס ה-LED שלנו עוד יותר כמערכת אלחוטית עם מספר יתרונות, כגון מורכבות מערכת נמוכה, עלות-תועלת וצריכת חשמל נמוכה.
ראשית, חברו את המחבר הנקבי בגובה 1.27 מילימטרים לקדם-מהאמפליפייר של שלב הראש. מקם את נורית ה- LED במארז המודפס בתלת-ממד. מדוד את עוצמת האור בקצה קצה הסיב האופטי באמצעות פוטודיודה.
יש לטבול את אלקטרודות הטונגסטן והסיבים האופטיים באלכוהול למשך 15 דקות ולייבש אותם באוויר. גילחו את עור הראש והניחו את העכבר המרומם במסגרת הסטריאוטקטית. מקמו את הראש בתוך המסגרת הסטריאוטקטית והכניסו מוטות אוזניים לתוך הבשר.
הפעילו את משטח החימום התרמי המוטמע במסגרת הסטריאוטקטית ושמרו על טמפרטורת הגוף ב-37 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליכים הכירורגיים. התאם את מוט החתך לקביעת גובה מוט החתך והידק את מהדק האף כנגד החוטם. כסו את העיניים בג'לי נפט כדי למנוע יובש.
הרימו את העור בראש עם מלקחיים, הבטיחו מקום הזרקה והזיקו 1% לידוקאין מתחת לקרקפת. בצע חתך sagittal באמצעות אזמל ומספריים עדינים. החזיקו את העור המעוגל במיקרו-רמה כדי להרחיב את הנראות של האזור הכירורגי.
מסירים את הפריוסטאום באמצעות צמר גפן. אם יש דימום, צרב את הגולגולת באמצעות בובי כדי לאטום את כלי הדם. נקו את הגולגולת עם מלח וסמנו את אתרי הגולגולת באמצעות זרוע מניפולטור.
קודחים חור מעל המוח הקטן ומחדירים בורג לקרקע. באמצעות בורג מדויק, לשים את בורג הקרקע 0.5 מילימטרים עמוק עד שהוא מגיע לחלק העליון של המוח הקטן. קודחים את האזור המסומן ומוציאים חתיכה מהגולגולת עם מלקחיים.
כופפו קצה מחט של 26 מדים בכיוון השעון בזווית של 120 מעלות וחשפו את אזור המוח על ידי החדרת הצד המשופע של המחט הפונה כלפי מעלה. תקן את מערך האופטרודה בזרוע המניפולטור והתקרב לאזור החשוף. הכניסו באיטיות את מערך האופטרודות וחברו את בורג ההארקה לחוט הכסף המחובר למערכת.
החדירו קצף ג'ל בין המוח החשוף לבין המכשיר כדי להגן על כימיקלים מפני מגע ישיר עם המוח. יש למרוח בזהירות מלט דנטלי על הגולגולת כדי לתקן את המכשיר ולכסות את קצף הג'ל. לפני שהמלט הדנטלי מוקשה לחלוטין, הפרד את הקרקפת אם היא מחוברת למלט הדנטלי.
משכו את העור המעוגל במלקחיים כדי לכסות את המלט הדנטלי הקשוח ותפרו את הקרקפת. מקם את העכבר המרדים במסגרת הסטריאוטקטית. הגדר את מתכון פולס האור למחזור עבודה של 4% בתדר הרץ של 10.
הגדר את גירוי האור למשך שתי שניות במהלך ההקלטה העצבית. הורידו את כיסוי הפלסטיק והצמידו את החלק העליון של מערכות העברת האור עם הנורית הרב-פעמית במעגלים. חברו את המקדם-מהאמפליפייר של שלב הראש למחבר בעל חמשת הפינים המושתלים.
פתח את התוכנה והגדר את מסנני התוכנה. לאחר מכן, לחץ והגדר קצב דגימת מגבר. לאחר מכן לחץ על שנה רוחב פס.
הגדר מגבר רוחב פס תחתון ורוחב פס עליון של מגבר. בדוק את מסנן DAC High-Pass של התוכנה. פתח את טווח הספייק ובדוק אותות עצביים באמצעות סף מתח.
לחץ על עצור והקלט. טען את הנתונים שנרכשו באמצעות MATLAB ובדוק נתונים גולמיים. לאחר מכן הפעל קוד מיון ספייק המכיל אלגוריתם גוש גלים.
בדוק קוצים ממוינים בעלילת רסטר. כעת מתווה ספירת קוצים ובודק קוצים מעוררים במהלך גירוי קל. האיור מציג צורות גלים שלמות שנרשמו עם תנאים מדויקים, כולל שתי שניות אור על התקופה באמצע.
מספר הקוצים העצביים האינדיבידואליים המתעוררים בעקבות כל דופק של גירוי אור גדל באופן משמעותי בהשוואה לנקודת ההתחלה עם סלים שונים של שתי שניות ו-0.2 שניות. האיור מציג היסטוגרמה של ספייק עבור כל ערוץ לפני, במהלך ואחרי גירוי האור. הנתון המוטבע מציין את מיקומו של מערך האופטרודה המושתל.
יתר על כן, הגרסה המוגדלת מציגה היסטוגרמה של ספייק עם סל זמן של 100 אלפיות השנייה. הסרגל הכחול מייצג את פרק הזמן שבו נורת ה-LED דולקת כדי לתעד את התגובה. כדי למזער את רעשי החפץ מתהליך זרם הנהיגה של LED, יש לתכנן את המערכת כך שתבטיח מרחק מספיק בין מסלול האותות החשמליים למעגל ה-LED.
מערכת האופטרודה המוצעת המבוססת על LED יכולה לחקור את האיתותים העצביים השונים הקשורים להתנהגות בעלי חיים מכיוון שהיא יכולה לספק גירוי אופטוגנטי ולתעד את התגובות העצביות המעוררות. מערך LED optrode תואם לממשק האופטוגנטיקה האלחוטית, שניתן להשתמש בו במחקר חופשי בבעלי חיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מערכת אופטרודה (optrode) חדשנית המשלבת סיבים אופטיים להולכת אור ומערך אלקטרודות להקלטה עצבית. ההיתכנות של מערכת זו הודגמה באמצעות ניסויי in vivo שנערכו בעכברים טרנסגניים המבטאים channelrhodopsin-2, מה שמאפשר גירוי אופטוגנטי והקלטה אלקטרופיזיולוגית בו-זמנית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- אופטוגנטיקה
רקע
- אופטוגנטיקה היא טכניקה להבנת מחלות נוירולוגיות.
- המחקר שואף לשפר את יכולות ההקלטה העצבית.
- מערכות אלחוטיות הן קריטיות ליישומים רחבים יותר באופטוגנטיקה.
- נורות LED מספקות יתרונות על פני לייזרים מבחינת פשטות ועלות.
מטרת המחקר
- להרכיב מערכת אופטרודה יעילה לגירוי אורי והקלטה.
- לחקור תגובות עצביות הקשורות לגירוי אורִי.
- להדגים את ישימותה של המערכת בבעלי חיים הנעים באופן חופשי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פותחה מערכת אופטרודות מבוססת LED לתפקוד סימולטני.
- עכברים טרנסגניים המבטאים channelrhodopsin-2 שימשו כמודל הביולוגי.
- ניסויי in vivo כללו הליכים כירורגיים למיקום המכשיר.
- בוצעו מדידות של עוצמת האור ומניפולציות כירורגיות שונות.
- רכישת הנתונים, כולל מיון ואנליזה של פריקות עצביות (neural spikes), בוצעה באמצעות MATLAB.
תוצאות עיקריות
- המחקר חושף עלייה בפריקים עצביים מעוררים במהלך גירוי באור בהשוואה לקו הבסיס.
- תועדו עליות משמעותיות בפריקים עצביים בודדים בעקבות פולסים של אור.
- מראה על הפוטנציאל של מערכת זו לחקור סיגנלינג עצבי הקשור לתגובות התנהגותיות.
- המערכת ממזערת רעשי ארטיפקטים הודות לתכנונה ולהגדרתה.
מסקנות
- מחקר זה מדגים כי מערכת האופטרודה המבוססת על LED משלבת ביעילות גרייה אופטוגנטית והקלטה עצבית.
- הממצאים מראים פוטנציאל ליישום בחקר תופעות נוירוביולוגיות שונות.
- ההשלכות כוללות חקירה של פתולוגיה ומנגנוני טיפול במצבים נוירולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודולציה אופטוגנטית והקלטה עצבית חשמלית בו-זמנית נותנות מענה לצורך קריטי בחקירה של מעגלים עצביים בזמן אמת ובאופן ספציפי לסוג התא, במדעי העצבים ובמחקר הפארמה-נוירולוגי הפרה-קליניים.&ד. פלטפורמה משולבת זו של מערך אופטרודות (optrode array) מאפשרת מיפוי מדויק של התגובה העצבית לגירוי ממוקד, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובהגברת הביטחון החזוי בשלבי תיקוף מוקדמים של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS). גישה זו משפרת את הרציפות התרגומית (translational continuity) באמצעות אספקת נתונים כמותיים של פעילות עצבית מסונכרנת בזמן (time-locked) במודלים של בעלי חיים הרלוונטיים למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור של מודולציה אופטוגנטית לתוצאות אלקטרופיזיולוגיות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות הפעלה או עיכוב סלקטיביים של אוכלוסיות נוירונליות שהוגדרו גנטית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי ביסוס מתאם בין פעילות של מעגלים עצביים לבין התערבות מועמדת.
- מספק נתונים כמותיים עם רזולוציית זמן לביסוס החלטות לגבי תיעדוף הפורטפוליו.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק תוצאות קריאה עצביות מתוקשפות וניתנות לשחזור עבור תהליכי סינון תרכובות המשכיים.
- מסטנדרטי את תנאי הבדיקה על ידי שילוב של מודליות אופטיות וחשמליות במכשיר השתלה יחיד.
- מאפשר מדידה כמותית בנאמנות גבוהה של פעימות עצביות מעוררות להערכה מהימנה של תרכובות.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מספר מטרות ומודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה בין מדידות של פעילות עצבית פרה-קלינית לבין נקודות קצה רלוונטיות למחלה במודלים של בעלי חיים.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני באמצעות אפשור קריאות תפקודיות in vivo.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי תמיכה בתיאום סממנים ביולוגיים ובהבנה מכניסטית.
- מסייע בקבלת החלטות לגבי קידום מבוסס התאמה לסיכון, על בסיס נתונים כמותיים של תגובות עצביות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פלטפורמת מערך האופטרודות (optrode array) זו משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים לבין תיקוף תרגומי במחקרי מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות למודולציה עצבית סלקטיבית ולהקלטה.
- סריקה: מספקת פלטי פעילות עצבית כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת נתוני פריקה (spikes) מסונכרני זמן ופלטים סטטיסטיים להשוואת תנאים ותמיכה בקבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: מקשרת פעילות עצבית in vivo למודלים של מחלות, ותומכת בהלימה של סמנים ביולוגיים ונקודות סיום.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית וניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה למגוון מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ולמודלים של בעלי חיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של תהליכי עבודה של רישום עצבי.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים תפקודיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של תוכניות CNS מותאמי סיכונים, בהתבסס על נקודות קצה עצביות כמותיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באופטוגנטיקה, אלקטרופיזיולוגיה וניתוח בעלי חיים לצורך השתלת מכשירים ואיסוף נתונים.
- נדרש מיכשור להולכת אור מדויקת, הגברה של אותות עצביים ואנליזה של מיון פולסים (spike sorting).
- נדרש סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של פרוטוקולי סטימולציה ושל תהליכי (pipelines) ניתוח נתונים.
- ניתן להתאימו למודלים שונים של מכרסמים המבטאים אופסינים, אך עשויה להידרש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור אזורי מוח או סוגי תאים שונים.
- נדרשות אסטרטגיות למזעור ארטיפקטים כדי להפריד בין ארטיפקטים של סטימולציה אופטית לבין אותות עצביים אמיתיים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:13
Preparation of an Optrode Array
1:39
Presurgical Preparation of Animal and Implantation Surgery
3:45
Setting Parameters and Conducting Optogenetic Stimulation, Electrophysiological Recording, and Data Analysis
4:55
Results: Electrophysiological Recording
5:40
Conclusion
