קביעת זיקה מחייבת (K_D) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים

שיטה זו יכולה לקבוע את הזיקה המחייבת של נוגדן בעל תווית רדיו לאנטיגן שלו. הוא גם ימדוד את הספציפיות של הכריכה. היתרון העיקרי של שיטה פשוטה זו הוא האפיון הספציפי של זיקה מקשרת רק של הנוגדן בעל התווית הרדיולית ללא הפרעה מצד הנוגדן ההורי הבלתי מעורער.

טכניקה זו מאמתת באופן כמותי את יכולתו של נוגדן בעל תווית רדיו להיקשר למטרה שלו. זה חשוב ליישומים בהדמיה גרעינית ובטיפול גרעיני במגוון מחלות. מי שתדגים את ההליך תהיה אריקה בליצקי, עמיתה לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, להכין מאגר אימוביליזציה על ידי הוספת 191 מיליגרם של נתרן ביקרבונט ו 23.9 מיליגרם של נתרן פחמתי לצינור חרוטי 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 40 מיליליטרים של 18 מגה-אוהם מים והתמוססו על ידי מערבולות. כעת, התאם את ה- pH ל- 9.0 לפני שתביא את הנפח הכולל ל- 50 מיליליטר.

לאחר מכן, הכינו 200 מיליליטרים של מאגר כביסה על ידי הוספת 200 מיליליטרים של PBS ו-100 מיקרוליטרים של Tween 20 לבקבוק של 250 מיליליטר. כמו כן להכין 50 מיליליטרים של מאגר קשירת על ידי הוספת 50 מיליגרם של BSA ו -25 מיקרוליטרים של Tween 20 עד 50 מיליליטרים של PBS ולערבב על ידי מערבולת. הוסיפו 1.5 גרם של BSA ל-50 מיליליטר של PBS כדי להכין את המאגר החוסם ואת המערבולת בעדינות לערבוב.

לדלל את האנטיגן במאגר האימוביליזציה. לאחר מכן, קחו צלחת שטוחה ניתנת לשבירה, בעלת 96 בארות, והוסיפו 100 מיקרוליטרים של אנטיגן לתחתית כל באר של 24 בארות במערך של שמונה על שלושה. מכסים את הצלחת בסרט איטום ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם חיץ כביסה. הופכים את הצלחת במהירות בכיור כדי להשליך את הנוזל ומקישים על הצלחת על ערימת מגבות נייר כדי להסיר את הנוזל העודף. לאחר מכן, לבארות המכילות את האנטיגן, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.

הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מאגר חוסם לכל באר הן לבארות מצופות 24 אנטיגן והן ל-24 בארות ריקות של צלחת 96 הקידוחים. לאחר מכן, דגירו את הצלחת למשך שעה אחת בטמפרטורת הסביבה ושטפו כל באר של הצלחת שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטרים של חיץ כביסה. בצע דילולים סדרתיים משולשים של הנוגדן בעל התוויות הרדיו-מתויגות במאגר הקישור עבור שמונה שורות המוגדרות כ-A עד H על הלוח.

ראשית, חישבו את נפח הנוגדן בעל התוויות הרדיו המלאי הנדרשות ליצירת תמיסה של 1.2 מיליליטר בריכוז הראשון. לאחר מכן, הוסיפו 800 מיקרוליטרים של חיץ קשירת קשירה לצינורות microcentrifuge המסומנים ב-B ל-H והוסיפו את הנפח הנדרש של חיץ קשירת קשירה לצינור A ולמערבולת בעדינות לצינור A ולמערבולת בעדינות. לאחר מכן, סובבו כלפי מטה באמצעות מיני-מיקרו-צנטריפוג' כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הצינור.

לאחר מכן, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של נוזל משני A לצינור B.לאחר מערבולת, סובבו אותו כלפי מטה באמצעות מיני-מיקרו-צנטריפוג'. באופן דומה, הוסיפו תמיסה מצינור B לצינור C, C עד D, עד צינור H.הוסף 100 מיקרוליטרים של כל דילול לכל באר לשלוש בארות משותקות עם אנטיגן ושלוש בארות חסומות עם BSA בלבד. כעת, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של כל דילול לצינורות המיקרוצנטריפוגה המסומנים בתקן A לתקן H ושמרו את הצינורות הללו כתקני נוגדנים עם תווית רדיולית שיש לבדוק במונה הגמא.

דגירו את הצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה. תייג צינורות מיקרו-סנטריפוג' עבור כל באר כמתואר בכתב היד. שאפו את הנוגדן בעל התוויות הרדיו מהבארות של צלחת 96 הבארות באמצעות שאיפת ואקום.

כעת, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל באר. שאפו למאגר הכביסה וחזרו על הכביסה ארבע פעמים נוספות. מפרקים את הבארות לצינורות המיקרו-צנטריפוג' המתאימים.

ספרו את הרדיואקטיביות בצינורות כאשר האנטיגן מסומן כ-H1, H2, H3, H3 עד A1, A2, A3, ולאחר מכן עם BSA המסומן רק כ-H4, H5, H6, ל-A4, A5, A6 באמצעות מונה גמא. Amivantamab עם תווית רדיו הראתה קשירת קשר ספציפית לחלבונים EGFR ו-cMET. זיקות דומות לקשירת קשר נשמרו גם על ידי פאבים בעלי תווית רדיו חד-זרועית הקשורים לחלבונים EGFR ו-cMET.

חלקות קשירת הרוויה הראו שכאשר הריכוזים של נוגדנים בעלי תווית רדיו היו נמוכים מדי, לא הושגה רוויה, כפי שמעידה העקומה הליניארית. ריכוזים של נוגדנים בעלי תווית רדיולית שהיו גבוהים מדי הובילו לרוויה ללא צמיחה לוגריתמית מובחנת, כפי שמראה המישור האופקי. כמו כן, נצפתה קשירת קשר לא ספציפית גבוהה עקב ריכוזים גבוהים של נוגדנים בעלי תווית רדיו.

הליך זה עשוי לדרוש ניסיונות מרובים לייעל את טווח הריכוזים עבור כל נוגדן ספציפי עם תווית רדיו. השתמש בנתונים מתוצאות שליליות כדי לסייע בתכנון ניסויים עתידיים. ברגע שידוע על זיקה מחייבת, ניתן להשתמש בה כאמת מידה לבדיקות חוץ גופיות אחרות כחלק מאפיון של נוגדן בעל תווית רדיו.