ספציפי כריכת נוגדן עבור קאפה (Vκ) שרשרת המכילה באור אנושי (IgM) נוגדנים: Polysialic החומצה (PSA) מצורפים NCAM כמקרה מבחן

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אנטיגנים לנוגדנים בעלי פוטנציאל טיפולי תוך התמקדות באיזוטיפ IgM. שיטה זו ממלאת פער ידע בתחום הביו-רפואי ועשויה לסייע בזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים ותרופות אימונותרפיות לחקר הסרטן ומחלות של מערכת העצבים המרכזית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא פותחת את הדלת לסוג מוזנח של נוגדנים בעלי פוטנציאל טיפולי רב.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון וטיפול בכל המחלות שיכולות להיות ממוקדות על ידי טיפולים מבוססי נוגדנים. מה העניין הזה יכול לספק תובנה לגבי אנטיגנים של נוגדני IgM ורקמות ותת-תרביות גדלות. זה יכול גם להוות מכה לאיזוטיפים אחרים של נוגדנים מכל המינים.

הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כאשר הבנתי קשירה ספציפית ובולטת של נוגדן IgM ביישומים ביוכימיים שונים. מי שידגים את ההליך יהיו רוברט קאהוד וינס ווצלאוויק. כדי להתחיל בהליך זה, בצע חתך בגולגולת לכיוון הקדמי בגובה האוזן וקילף את הגולגולת לאחור.

לאחר מכן, הניחו בעדינות את המוח לתוך שפופרת של 15 מיליליטר, ואחסנו אותו מיד על קרח יבש. לאחר חמש דקות, העבירו את המוח לנייר שקילה נקי והסירו במהירות את המוח הקטן ואת גזע המוח באמצעות סכין גילוח נקי. לאחר מכן, שקלו את המוח הקפוא לפני העברתו בחזרה לצינור של 15 מיליליטר על קרח.

הוסף מאגר ליזיס קר כקרח לריכוז סופי של 150 מיקרוגרם של רקמת מוח למיקרוליטר של מאגר ליזה. לאחר מכן, הומוגניזציה של המוח במאגר ליזה על ידי טריטורציה דרך קצה פיפטה של מיליליטר אחד ואחריו טריטורציה באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר המצויד במחט בגודל 27. לאחר מכן, דגרו את המוח ליזאט למשך 30 דקות נוספות על קרח כדי לאפשר ליזה מלאה של רקמות.

לאחר 30 דקות, הסר חומר ניקוי, חומר בלתי מסיס ושומנים במוח לצנטריפוגה סדרתית. השליכו את המיאלין ואת פסולת התאים המכילים גלולה, אך שמרו על הסופרנטנט לאחר כל שלב צנטריפוגה. יש להזין את המוח, ולאחסן בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.

בשלב זה, הכינו 200 מיליליטר של מאגר IP עם BSA ועוד 200 מיליליטר של מאגר IP ללא BSA. לתגובת המשקעים החיסוניים, העבירו 100 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז חלבון L לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של מאגר IP עם BSA לשפופרת.

לאחר מכן, ערבב אותו ידנית על ידי היפוך. לאחר מכן, שטפו חרוזי אגרוז חלבון L ארבע פעמים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור האגרוז וחזור על הליך הכביסה שלוש פעמים נוספות.

לאחר מכן, הוסיפו BSA טרי המכיל מאגר IP לחלבון L אגרוז ודגרו אותו למשך הלילה על רולר בארבע מעלות צלזיוס. ב-800 מיקרוליטר של מאגר IP המכיל BSA ו-30 מיליגרם של רקמת מוח ליזה, הוסף 20 מיקרוגרם של נוגדן ניסיוני, נוגדן ביקורת או PBS. דגרו 30 מיליגרם של רקמת מוח ליזה במאגר IP קר כקרח עם נוגדן IgM בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מילימטר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, סובב חרוזי אגרוז חלבון L בצנטריפוגה על ספסל. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור האגרוז. לאחר מכן, הוסף את תמיסת הליזאט המוחי של הנוגדן המצונן, לחלבון L אגרוז.

דגרו את האנטיגן של הנוגדן, תרחיף אגרוז חלבון L למשך שעתיים על רולר בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים, שטפו את קומפלקס הנוגדנים המחובר לאגרוז L באמצעות צנטריפוגה. השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה והוסיפו אליו מיליליטר אחד של מאגר IP קר כקרח המכיל 0.2% BSA.

חזור על שלב הכביסה פעם נוספת באמצעות מאגר IP קר כקרח המכיל 0.2% BSA ופעמיים נוספות באמצעות מאגר IP קר כקרח ללא BSA. לאחר מכן, סובב את קומפלקס האנטיגן של הנוגדנים המחובר לאגרוז L.השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להשליך את הסופרנטנט עד שנותר כ-50 מיקרוליטר מהתמיסה על גבי גלולת האגרוז של חלבון L. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להסיר אותה לחלוטין.

שמור את כל הדגימות על קרח. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של מאגר פליטת IP לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. יש להניף את הצינור שש פעמים ולחמם אותו במשך חמש דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הניחו את הדגימה על קרח למשך שתי דקות וסובבו אותה למשך 30 שניות. לאחר מכן, העבירו 35 מיקרוליטר של הסופרנטנט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מילימטר מבלי להפריע לגלולה. לאחר מכן, אשר את היעדר חרוזי אגרוז חלבון L על ידי שטיפת כמות קטנה של דגימה מדוללת בדופן הצינור הפנימי.

אם קיימים חרוזי אגרוז של חלבון L, סובב את הדגימה למשך 30 שניות נוספות ב-13,000 פעמים גרם והעביר את הסופרנטנט לצינור נקי. חזור על שלב זה עד שלא ניתן לזהות חרוזי אגרוז. לאחר מכן, טען 10-20 מיקרוליטר של דגימות מדוללות לבאר על ג'ל SDS פוליאקרילאמיד ומערכת חיץ טריס-גליצין SDS והפעל את הג'ל במשך כשעה ב-100 וולט על הספסל ללא קירור נוסף.

באופן שימושי, העבירו את החלבונים לקרום PVDF. חלבונים מועברים במשך שעתיים וחצי בחדר הקירור ב -100 וולט באמצעות מאגר העברה קרה. חסום את הממברנה עם 10% משקל לנפח אבקת חלב יבש ב-PBS-T למשך שעה ב-25 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי על ספסל.

שטפו אותו פעמיים במשך 10 דקות בכל פעם עם PBS-T. בדוק את הממברנה עם נוגדן ראשוני ב-5% BSA ב-PBS-T. דגירה על שייקר מסלולי בחדר הקירור למשך הלילה.

למחרת בבוקר, שטפו את הממברנה פעם אחת עם עודף PBS-T ב-25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן שלוש שטיפות עם PBS-T למשך 10 דקות כל אחת על שייקר מסלולי. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן משני ואבקת חלב יבש 5% ב-PBS-T לממברנה ודגרו אותה למשך שעה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי. לאחר מכן, שטפו את הממברנה פעם אחת עם עודף PBS-T ב-25 מעלות צלזיוס ואחריה שלוש שטיפות עם PBS-T למשך 10 דקות כל אחת על שייקר מסלולי.

מערבבים מיליליטר אחד של רכיב מצע HRP משופר מצונן, עם מיליליטר אחד של רכיב B ב-25 מעלות צלזיוס. מעבירים את הממברנה על מגבת נייר כדי להסיר עודפי נוזלים. לאחר מכן, יבש את המיכל במגבות נייר לפני העברת הממברנה בחזרה אליו.

מיד, הוסף שני מיליליטר של מצע ה-HRP המשופר המעורבב מראש לקרום ודגירה אותו למשך שתי דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. הטה את המיכל ביד כל 20 שניות כדי להרטיב את הממברנה בצורה אחידה. לאחר מכן, העבירו את הממברנה לשרוול פלסטיק שקוף והסירו עודפי נוזלים ובועות אוויר בעזרת מגבות נייר.

הדביקו את שרוול הפלסטיק לקלטת וסגרו אותו. איור זה מראה כי HigM12 מזרז את האנטיגן שלו מהמוח המוחי ופועל כחומר זיהוי בכתמים מערביים. לא נוגדן בקרת איזוטיפ ולא חרוזי אגרוז L מזרזים אנטיגן דומה המדגים את הספציפיות של המשיכה כלפי מטה.

כאן, כתמים מערביים המשתמשים בליזאטים של מערכת העצבים המרכזית מעכברי נוקאאוט מסוג בר ו-NCAM מדגימים את הספציפיות של קשירת HIgM ל-PSA המכילים NCAM'עיכול אנזימטי של רקמת מערכת העצבים המרכזית מעכברים מסוג בר באמצעות ENDO-NF מזהה PSA המחובר ל-NCAM כאפיטופ המחייב הספציפי ל-HIgM12. באמצעות השיטה המתוארת כאן, מתקבלות תרביות מיקרוגליה של חולדות חיוביות IBA-1 בטוהר גבוה. בניגוד למיקרוגליה, אנטיגנים פני השטח של תאי המטרה HIgM12 ו-A2B5 הועשרו מאוד בתרביות OPC של חולדות בתנאי תאים חיים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 13 שעות עבודה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו Biacore או טכנולוגיית תהודה של פלזמון פני השטח כדי לזהות את זיקות הנוגדנים הקשורים לקבועי אסוציאציה ואסוציאציה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הסרטן, אימונותרפיה ונוגדנים עצמיים טבעיים לזהות אפיטופים של פחמימות על חלבונים דומים כאנטיגנים לנוגדני IgM טיפוליים בבני אדם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לזהות אנטיגנים של גליקופרוטאין עבור עבודת מחקר המכילה נוגדני IgM אנושיים. הנתונים מספקים יעד חדש לטיפול בטרשת נפוצה. PSA ENCAP, טיפול הנוגדנים שפיתחנו הוא אחד הראשונים שהראו שיפור תפקודי בקופסת פעילות באמצעות המודל הקפדני שנמצא במחלה ומפחית את ערך המחלה בדומה לטרשת נפוצה.