מיפוי צפיפות ה-DNA המוחלטת בגרעיני התא באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה בודדת
11 בנובמבר 2025
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המודדת צפיפות DNA מוחלטת בתוך גרעיני תאים דבקים באמצעות טסלציה של וורונוי של נתוני מיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת, נפח ידוע, גודל גנום ושלב מחזור התא.
השיטה הנוכחית מאפשרת מדידות צפיפות DNA מוחלטות בגרעיני התא כדי לחקור את האילוצים המרחביים במבני כרומטין שאחרת מאופיינים רק בשינויים בהיסטון לאחר התרגום. טסלציה של וורונוי בשילוב עם SMLM מאפשרת הערכות צפיפות מוחלטת של DNA במונחים של זוג בסיסים למיקרומטר מרובע. הידע האפריורי היחיד הדרוש הוא תכולת ה-DNA הכוללת של גרעין התא הנמדד.
בניסויים עתידיים, יהיה מעניין לחקור האם הבדלי צפיפות מוחלטים קשורים למידע ביולוגי משיטות אחרות, כגון אימונופלואורסצנציה של שינויים אפיגנטיים או נתוני Hi-C. התחל בשחזור האזור הסרוק על-ידי סידור התמונות הבודדות שהוקלטו מראש יחד. פתח את CellProfiler ולאחר מכן טען את צינור cellcycleanalysis.cpproj.
בתמונות השלב הראשון של הצינור, גרור ושחרר את התמונות, כולל תמונת ההפניה. לאחר מכן, הגדר מיקום שבו יאוחסנו תמונות ההתייחסות. לאחר מכן לחץ על סמל התחל מצב בדיקה ואחריו הפעל.
לאחר הצגת ההיסטוגרמה של הגרעינים בתמונה שיש לנתח, קבע את מרווחי העוצמה עבור שלבי G1, S ו- G2, וודא שהם מוזנים בשלבי אובייקט המסנן הבאים של הצינור וכי שלבים אלה פעילים. לאחר מכן לחץ שוב על כפתור ההפעלה כדי להמשיך במחצית השנייה של הצינור. התבוננו בשלוש התמונות עם השכבות המייצגות את שלבי מחזור התא השונים, G1, S או G2, ובחרו את הגרעינים ב-G1 או G2 להדמיה נוספת כך שכמות ה-DNA בזוגות הבסיסים של גרעיני התמונה תהיה ידועה.
מקם מחדש את התאים במיקרוסקופ הלוקליזציה של מולקולה בודדת, והקפד על מצמוץ נכון של תהליך ה-FPALM. ראשית, הקלט ערימה תלת מימדית של הגרעין הנבחר רק באמצעות 500 פריימים לפרוסה. זה מאפשר לקבוע את הכמות היחסית של ה-DNA בחלק האמצעי, שמצולם מאוחר יותר עם מסגרות רבות נוספות כדי לחשוף את המבנה האולטרה-מבני שלו.
התחל את רכישת סדרת התמונות באמצעות זמן חשיפה של 50 אלפיות השנייה, והתוצאה היא קצב פריימים של כ-20 פריימים לשנייה. קח ערימת Z דרך הגרעין עם מרווחי צעדים של 200 ננומטר ורק 500 פריימים לכל קטע אופטי של אור. לאחר רכישת המחסנית, חזור למיקום z הראשוני ורכוש את מערך הנתונים הראשי של 50,000 פריימים עם אותו זמן חשיפה של 50 אלפיות השנייה.
פתח את מערך הנתונים של FPALM ב-ImageJ. כדי לייעל את ההגדרות לזיהוי אותות מהבהבים, לחץ על ThunderSTORM ולאחר מכן הפעל ניתוח. כעת, בחר הגדרת מצלמה.
הזן את גודל הפיקסלים הנכון של נתוני התמונה, ספירת ה-A/D, היעילות הקוונטית של המצלמה המשומשת, רמת הבסיס ורווח EM, ולאחר מכן לחץ על אישור. בחר את האלגוריתם לקביעת קואורדינטות הלוקליזציה על ידי התאמת האותות המהבהבים. בקטע סינון תמונה, השתמש במסנן Wavelet B-Spline עם סדר B-Spline 3 וסולם B-Spline 2. לאחר מכן, הגדר את שיטת הלוקליזציה המשוערת של מולקולות למקסימום מקומי, הגדר את סף עוצמת השיא והקישוריות ל-8 שכונות.
בסעיף לוקליזציה תת-פיקסלית של מולקולות, כשיטה, בחר גאוס משולב PSF, הגדר את רדיוס ההתאמה px ל-3, בחר שיטת התאמה כסבירות מקסימלית, והגדר את הסיגמא הראשונית ל-1.6. לאחר מכן לחץ על אישור כדי להתחיל בזיהוי האותות ובשחזור התמונה. אם הרכישה מחולקת לערימות תמונות שונות, שרשר את טבלאות הלוקליזציה ב-ThunderSTORM.
לשם כך, לחץ על ייבוא בחלון המוקפץ. ודא שהאפשרות הוסף לטבלה הנוכחית מופעלת ושנעשה שימוש במספר ההתחלתי הנכון כדי למנוע עקיפת לוקליזציות בטבלה. לאחר מכן בחר את נתיב הקובץ ולחץ על OK כדי לייבא קובץ אחד אחרי השני.
כדי למנוע ספירת יתר של אותות במסגרות עוקבות, מזגו את נתוני הלוקליזציה באמצעות מרחק מרבי של 20 ננומטר, 1 פריימים לכל היותר ו-0 פריימים לכל מולקולה, ולאחר מכן לחצו על Merge. כדי למדוד ולתקן סחיפה על ידי מתאם צולב של תת-מקטעי נתונים, פתח את תפריט תיקון הסחיפה ולחץ על החצים. הוסף 3 סלים והגדר את ההגדלה ל-5.
לאחר מכן לחץ על החל, והחלון המציג את הסחף x ו-y יופיע. כדי לקבוע את כמות האות הפרופורציונלית לתוכן ה- DNA בכל פרוסה של הערימה התלת-ממדית המוקלטת מראש עם 500 מסגרות לכל פרוסה, בחר Plugins, לאחר מכן ThunderSTORM ולאחר מכן Import/Export, וייבא את טבלת התוצאות לפרוסה הראשונה של הערימה. כדי למנוע ספירת יתר של אותות ממישורי תמונה אחרים של הערימה התלת-ממדית, יש להסיר אותות מחוץ למרווח הצעדים של 200 ננומטר ב-z בין הפרוסות.
לחץ על התוויית היסטוגרמה ובתיבת הדו-שיח הפתוחה הפצה, בחר z ולחץ על אישור. קבע את מיקום השיא והשתמש בשדה המסנן כדי לבחור את האותות בגודל הצעד האופטי של 200 ננומטר. לחץ על ויזואליזציה ובחר באפשרות היסטוגרמות ולאחר מכן לחץ על אישור. שמור את התמונה המתקבלת בתיקייה בתבנית TIFF. פתחו את כל הפרוסות ושלבו אותן באמצעות Image ולאחר מכן Stacks ולאחר מכן Images to Stack.
לאחר בחירת כל אזור התמונה, עבור אל ניתוח, לחץ על כלים ובחר את מנהל החזר ההשקעה. לחץ על הוסף, לאחר מכן לחץ על ניתוח, ולאחר מכן הגדר מדידות ובחר צפיפות משולבת. כעת, בחר באפשרות עוד, בחר Multi Measure, סמן את מדוד את כל הערימות וכן שורה אחת לכל פרוסה.
לחץ על אישור והתוצאות יופיעו. סכום העוצמות של כל הפרוסות הוא פרופורציונלי לתכולת ה-DNA של הגרעין כולו באותו אופן שבו העוצמות של פרוסות בודדות פרופורציונליות לחלק שלהן בגנום כולו. לאחר פתיחת טבלת התוצאות של המישור המרכזי המכילה את האותות של 50, 000 פריימים, סנן אותה לעובי של 100 ננומטר.
צור את ההיסטוגרמה של האותות המתקבלים כפי שהודגם קודם לכן, ומדוד את הצפיפות המשולבת של החלק המרכזי. המר את טבלת הלוקליזציה הגדולה של ThunderSTORM המכילה את המידע האולטרה-מבני מהחלק המרכזי מפורמט csv לפורמט ORTE על ידי הפעלת סקריפט MATLAB TS2orte. m, שהופך את טבלת הלוקליזציה למטריצת MATLAB ושומר אותה בפורמט MAT.
היכנס לתיקיית LAND-voronoi, ובתיקיית המשנה coreAlgorithm, פתח את הקובץ voronoicluster. m ולהתאים את תכולת ה-DNA, חלק מהחלק המרכזי הנצפה של כל שבר הגרעין DNA ולוקליזציות, ואת גורם ההמרה בהתאם לסוג התא המשומש ושלב מחזור התא לחישובי הצפיפות המוחלטת. ערוך את קובץ ה- Script שמתחיל את הניתוח voronoi.m.
התאם את נתיב הקובץ לנתוני הלוקליזציה של orte ולתיקיית הפלט עבור קבצי התוצאה. ציין את הקואורדינטות המגדירות את האזור שבו יש לבצע את הטסלציה. הגדר אזורים מרובים לחישוב בתוך אותו מערך נתוני קלט.
לאחר הפעלת הסקריפט, חפש את התמונה המציגה את צפיפות ה-DNA המוחלטת יחד עם קבצים אחרים המכילים גרפים המציגים את ההיסטוגרמה של התפלגות השטח, וצפיפות. m המכיל את הצפיפות של כל תא Voronoi מחושב בתיקיית הפלט. מדידת FPALM המורכבת מ-50,000 פריימים הביאה ל-2.68 כפול 10 בחזקת 6 לוקליזציות שזוהו בתוך חתך אמצע בעובי 100 ננומטר.
דיוק הלוקליזציה של התמונה המשוחזרת היה 10 ננומטר. המספר הגדול של לוקליזציות איפשר שילוב של הדמיה ברזולוציה גבוהה תוך הצגת צפיפות DNA מוחלטת. היה ברור שצפיפות ה-DNA שנמדדה לא הייתה מפוזרת באופן אחיד על פני הגרעין וכיסה טווח דינמי נרחב.
הגדלות גבוהות יותר של אזורים בתוך הגרעין המראים תאי וורונוי גדולים יותר הצביעו על צפיפות DNA נמוכה, בעוד שתאים קטנים יותר הצביעו על צפיפות DNA גבוהה. צפיפות ה-DNA שנמדדה בחצי גרעין G1C3H10T הראו את התפלגות צפיפות ה-DNA המוחלטת בתוך הגרעין מסוג ומין אחר. למרות שהארגון הבסיסי נראה כמו גרעין הלה G1 המוקדם, היו לו בנוסף אשכולות מכוננים של הטרוכרומטין פרצנטרי.
לא נצפו שינויים ארכיטקטוניים דרמטיים בגרעין G2 למרות גודל גרעיני מוגדל מעט. גרעין HeLa שטופל ב-TSA הראה הבדלים יוצאי דופן ביחס לטופוגרפיה גרעינית וצפיפות DNA. מלבד ההטרוכרומטין ההיקפי, שהראה איים בעלי צפיפות DNA גבוהה יותר, שאר הכרומטין נראה הרבה יותר הומוגני ומעובה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתאר שיטה למדידת צפיפויות DNA מוחלטות בתוך גרעיני תאים הדבקים, תוך שימוש בטסלציה של וורונוי (Voronoi tessellation) של נתוני מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולות בודדות (SMLM). גישה זו מאפשרת לחקור מגבלות מרחביות במבני כרומטין, תוך קישור בין מידע גנטי לבין שלבים במחזור התא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
- טכניקות של מיקרוסקופיה והדמיה
רקע
- הבנת צפיפות ה-DNA היא קריטית לחקר ארכיטקטורת הכרומטין.
- שיטות נוכחיות מסתמכות לרוב על מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות של היסטונים.
- ידע על תוכן ה-DNA הכולל חיוני לצורך מדידות מדויקות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טסלציית וורונוי (Voronoi tessellation) של נתוני SMLM
- גרעיני תאים הדבקים כמערכת ביולוגית
- תוכנות לניתוח תמונות כגון CellProfiler ו-ImageJ
תוצאות עיקריות
- המדידות מניבות צפיפויות DNA המבוטאות בזוגות בסיסים לסמיקרומטר רבוע.
- כיווני מחקר עתידיים כוללים את קשירת הבדלי הצפיפות לשינויים אפיגנטיים.
- השיטה מתקפת את השפעת שלבי מחזור התא על מדידת תכולת ה-DNA.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר הערכות מדויקות של צפיפות ה-DNA בגרעיני תאים.
- המחקר סולל את הדרך לשילוב של נתונים גנומיים עם מאפיינים פיזיקליים של כרומטין.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי כמותי של צפיפות DNA מוחלטת בגרעיני תאים נותן מענה לפער קריטי בהבנת ארכיטקטורת הכרומטין מעבר לסימונים אפיגנטיים, ומאפשר הערכה ישירה של מגבלות מרחביות שעשויות להשפיע על בקרה גנטית. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזואי בשלבים מוקדמים של הגילוי, על ידי אספקת נתונים כמותיים ברזולוציה גבוהה על הארגון הגרעיני, הרלוונטיים לתיקוף מטרות ולהפחתת סיכונים מכניסטיים. שילוב של מדידות צפיפות DNA בעלות רזולוציה מרחבית תומך בקבלת החלטות מותאמות סיכון עבור פורטפוליו בשלבי מפתח של תהליכי הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של הארגון המרחבי של הכרומטין לצורך תיקוף של מטרות פונקציונליות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות שינויים בצפיפות ה-DNA הקשורים למצבי פעילות של גנים.
- מספק מסגרת כמותית לבדיקת היפותזות הנוגעות למגבלות מרחביות בבקרת גנים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מקל על הכנת מודלים גרעיניים מתוקתקים עבור בדיקות כרומטין או בדיקות אפיגנטיות המשך.
- מספק תוצרי צפיפות DNA כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר השוואה חסונה של מצבי כרומטין בין שלבים שונים במחזור התא ותנאי טיפול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מיפוי צפיפות כרומטין לפנוטיפים גרעיניים הרלוונטיים למחלה כאשר הוא משולב עם נתונים אורתוגונליים.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי קישור מאפיינים פיזיים של הכרומטין למדדים פונקציונליים.
- מספק הפחתת סיכונים חיזויית עבור אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לכרומטין.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו ממוקמת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית ועד לזיקוק מודלים פרה-קליניים, ומאפשרת שילוב של נתוני כרומטין מרחביים עם ניתוחים פונקציונליים ואפיגנטיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בחקירה מונחית-השערות של אילוצים מרחביים של כרומטין והשלכותיהם הרגולטוריות.
- סריקה: מספק מדדי צפיפות DNA כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר מפות צפיפות ברזולוציה גבוהה ובסיס סטטיסטי חסון לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה של ארכיטקטורת הכרומטין למודלים של מחלות כאשר הוא משולב עם נתונים מולקולריים נוספים.
- שימוש חוזר בארגון: מבסס זרימת עבודה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר לניתוח ארכיטקטורה גרעינית על פני סוגי תאים ותנאים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בביולוגיה של כרומטין.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדידת צפיפות גרעינית עם הדירות גבוהה ויכולת התרחבות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים מרחביים כמותיים על ארגון הכרומטין.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של מטרות ואסטרטגיות לשינוי כרומטין בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת ובניתוח תמונות מתקדם.
- מחייב גישה לפלטפורמות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה ולתשתית מחשוב לעיבוד נתונים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדמיה וניתוח לצורך הדירות (reproducibility).
- התאמה לסוגי תאים ולשלבים שונים במחזור התא דורשת כיול קפדני של תכולת ה-DNA ושל פרמטרי הסגמנטציה.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בתכולת DNA כוללת מדויקת ואפשרות לשילוב עם נתונים מולקולריים אורתוגונליים.
