זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד באופן אובייקטיבי את התגובות של תאים בודדים על ידי כימות עוצמות סמן פלואורסצנטי ספציפיות מתמונות מיקרוסקופ. זה מושג על ידי חשיפה ראשונה של תאי תרבית רקמה דבקים להפלת גנים בתיווך irna. בשלב השני, התאים מוכתמים בפלואורסצנט ולאחר מכן מצולמים עבור מספר סמנים מעניינים.

בשלב האחרון, ביטוי הסמנים באזורים תת-תאיים ספציפיים מוגדר באופן אלגוריתמי, הם תאים בודדים. בסופו של דבר, ניתן לנתח את התגובות התאיות לרמזים ביולוגיים מהפלת גנים על ידי מדידת רמות הביטוי הפלואורסצנטיות של הסמנים המעניינים והטרנסלוקציה התת-תאית שלהם. למרות שהליך זה מספק תובנה לגבי ויסות מעבר מחזור התא G One בתגובה ל-siRNAs.

ניתן ליישם אותו גם במחקרים המייצרים תמונות של תאים פלואורסצנטיים, חקר הובלה גרעינית והומאוסטזיס חלבונים. מי שידגים את ההליך יהיו דניאל ווק ועמיתי הפוסט-דוקטורט קאר K HO מהמעבדה שלי התחילו על ידי חלוקת 70 מיקרוליטר של 200 ננו-מולרי אירנה, מדולל חוצץ אירנה לבארות המתאימות של צלחת סטרילית של 96 בארות במכסה מנוע סטרילי של תרבית רקמה. לאחר מכן הוסף 105 מיקרוליטר של שומן טרנספקציה מדולל ב-40 נפחים של מדיום DMEM ללא סרום לכל באר של אדוני ערבב את הצלחת על ידי רטט עדין של טמפרטורת החדר, ולאחר מכן לאחר 10 דקות, חלק את 175 המיקרוליטר המתקבלים לשלושה שכפולים של 50 מיקרוליטר לכל מטרה לתרבית רקמה אטומה שטופלה בצלחת 96 בארות עם בסיס שקוף.

לאחר מכן, יש להוציא 8,000 תאים לבאר ב-150 מיקרוליטר של DMEM עם סרום של 10% ישירות על קומפלקסי אירנה של 50 מיקרוליטר ליפידים ללא ערבוב. לאחר מכן אטמו את הצלחת עם קרום נושם דבק סטרילי והניחו את הצלחת בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. 48 שעות לאחר מכן שאפו את המדיה מהצלחות.

לאחר מכן תקן את התאים ב 100 מיקרוליטר של פורמלדהיד 4% חוצץ במכסה אדים בטמפרטורת החדר לאחר 10 דקות, שאפו את הקיבוע ובצעו שלוש שטיפות של 100 מיקרוליטר עם PBS לאחר הכביסה האחרונה. הסר את ה- PBS וניקוב התאים בשלושה מחזורים של תמיסת סלסול של 100 מיקרוליטר דגירה של 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר מבלי לרעוד. לאחר הדגירה האחרונה, הסר את תמיסת החדירה ואז הוסף 100 מיקרוליטר תמיסת בלוק לבאר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן שאפו את תמיסת הבלוק ובדקו את התאים עם 50 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי המעניין תוך שבועיים מסימון מיקרוסקופ קונפוקלי uc עם מטרה של פי 20 לצלם תמונות TIFF נפרדות בקנה מידה אפור של 16 סיביות בשלושה ערוצים המתאימים לצבע ה-DNA GFP וצביעה חיסונית. ארבע פלורה לוכדות קבוצות תמונות או מסגרות רבות שאינן חופפות כדי לצלם כ-1000 עד 2000 תאים לבאר. מתן שם לקובץ התמונה באופן שיטתי עם פרטי המטא נתונים כך שכל שם קובץ הוא שילוב ייחודי של שם הניסוי, כתובת באר, מספר מסגרת ומזהה ערוץ.

לאחר מכן פתח את תוכנת פרופיל התא ולחץ על צינור קובץ וייבוא. לאחר מכן, תחת קובץ, בחר את הקובץ קובץ צינור CP צינור שלושה ערוצים, המכיל את ההוראות הדרושות לתוכנה כדי לפרש את המטא נתונים של קובץ התמונה משם הקובץ השמור, כעת ניתן להשתמש ב-Convention Cell Profiler כדי לקשר את התמונות, לחלץ את ה-DNA הגרעיני ועוצמות הנוגדנים מהקבצים, ולהשתמש בערוץ GFP כדי לחשב את היחס בין עוצמת הגרעין לעומת הציטופלזמה. עבור כל תא שזוהה, לחץ על כפתור הגדרות הפלט של הצג ולאחר מכן לחץ על תיקיות הקלט המוגדרות כברירת מחדל ותיקיות הפלט המוגדרות כברירת מחדל.

בחירת המיקום של קבצי התמונה לניתוח והיעד לנתונים שחולצו בהתאמה. לאחר מכן, בחלון מודולי הניתוח, לחץ על סמלי העיניים המתאימים כדי לצפות בחלונות זיהוי אובייקטים ראשוניים ואובייקטים שלישוניים במהלך הניתוח ולחץ על נתח תמונות בסיום הניתוח. לחץ על אישור בתיבת ההודעה ועבור אל מיקום תיקיית הפלט המהווה ברירת מחדל שבו כל קבצי הנתונים נשמרים כקבצי ערכים מופרדים באמצעות פסיקים.

כדי לבצע את חילוץ הנתונים, מצא את קובץ ה-CSV החדש של הגרעינים הכלול בין הפלט מפרופיל התא, המכיל את נתוני התא הבודדים עבור עוצמת הנוגדנים הגרעיניים הפלואורסצנטיים, עוצמת ה-DNA הגרעיני וערכי יחס המדווח של GFP CDK. העתק את קובץ סקריפט הדופק שסופק כדי לעבור את מסווג ה-PL לאותה תיקיה כמו קובץ נתוני ה-CSV של הגרעין. לאחר מכן לחץ פעמיים על הסמל של Pearl Script.

וכאשר תתבקש, הקלד את השם המלא של קובץ הנתונים ואחריו שם קובץ DOT CSV עבור הקובץ שבו יש לסגור את התאים וערכי השער עבור הקרינה של הנוגדנים ונתוני המדווח G FP CDK שני. ודא שהקובץ החדש שנוצר משלב את ערכי הבדיקה הגולמיים של התא הבודד מפרופיל התא המקורי של הנתונים עם תוויות תת-האוכלוסייה המראות כיצד כל תא מכל באר מתפקד מול שני השערים. כעת פתח את תוכנת R Studio כדי להתוות את הנתונים עבור כל תנאי ניסוי באמצעות תוויות תת-אוכלוסיית התאים הבודדות על ידי לחיצה על קובץ ופתיחת קובץ, ולאחר מכן בחירת קובץ נקודת הניתוח שסופק.

הקלד את כתובת המחשב של התיקיה המכילה את הנתונים המגודרים, כולל אות הכונן ושם הקובץ עצמו. לאחר מכן סמן את שורות 1 עד 17 בחלון השמאלי העליון של הסטודיו שלנו, ולחץ על כפתור ההפעלה כדי להזין את ערכי סף הנתונים הניסיוניים ופרטי מיקום הבאר. לבסוף, סמן את הבלוקים הבודדים של הקוד הנותר מתחת לשורה 17, ולחץ על כפתור ההפעלה כדי ליצור את העלילות המתאימות.

התבונן בעלילות בחלון בפינה השמאלית התחתונה של הסטודיו שלנו, ולאחר מכן לחץ על כפתור הייצוא כדי לשמור אותם במגוון פורמטים. זרימת העבודה המתוארת כאן מנתחת את תמונות המיקרוסקופ הפלואורסצנטי כדי לייצר נתונים גולמיים בצורה של רשימה המפרטת כל תא שזוהה וערכי הבדיקה המתאימים לו. קיימות אפשרויות רבות לניתוח נתונים אלה.

לדוגמה, בעלילות היסטוגרמה אלה, ערכי הבדיקה עבור התאים שטופלו ב-RNA בקרה מאפשרים לזהות את השערים המתאימים לסף כל בדיקה. לאחר מכן מוחלים ספי השער באמצעות סקריפט דופק כדי לתייג כל תא בנתונים הגולמיים בהתאם לתוצאת הבדיקה. גישת תיוג זו מסייעת להערכה חזותית ראשונית כמו גם אוטומטית של הקשרים בין הטיפולים והתפלגות תת-האוכלוסייה אפילו של קבוצות גדולות מאוד של נתוני תאים בודדים.

לדוגמה, בניסוי מייצג זה, תנאי נוקדאון של שלוש אירנה הביאו להתפלגות מנוגדת של התאים ביחס לשערים הם שתי הבדיקות. תרשימי R משתמשים בתוויות כדי לחשב את התפלגות האחוזים של התאים בכל רבע. התוויות מאפשרות גם להצליב מדידות פלואורסצנטיות נוספות עם נתוני הבדיקה.

בניסוי זה, תת-האוכלוסיות של תאים שטופלו ב-SI CDK 6 קובצו על פי תוויות הבדיקה שלהן ושורטטו כהיסטוגרמות של צביעת DNA גרעינית. שימוש זה בתוויות נתוני התאים חושף את הקשר בין שתי בדיקות התאים לבין תכולת ה-DNA בתאים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב תמיד לזכור לבדוק ולהתאים את פרמטרי פילוח התמונה בעת שימוש בפרופיל תאים.

הדבר חשוב במיוחד בעת שימוש בקובצי תמונה חדשים או שלא נבדקו בפעם הראשונה. בסדר.