תכנון ביוריאקטור לשיפור איסוף הנתונים והפקת מודלים של רקמות לב מהונדסות

מודל invitro שלנו של שריר לב אנושי תלת ממדי שמקורו בתאי גזע משפר את הנאמנות הביולוגית של תרבית תאים דו-ממדית מסורתית תוך ביטול ההבדלים בין המינים הקשורים לניסויים בחיות מעבדה. תכנון הביוריאקטור הרב-רקמתי שלנו עם עוקבי פוסט יציבים ממקסם את הצלחת הרקמה ומשפר את דיוק האפיון המעמיק של תפקוד רקמת הלב המהונדסת. מכיוון שאי ספיקת לב ממשיכה להיות סיבת המוות המובילה ברחבי העולם, רקמות הלב המהונדסות שלנו מאפשרות לחוקרים למדל מחלות לב אנושיות, כמו גם לסנן טיפולים פוטנציאליים.

כדי להתחיל, מקם ארבע יציקות מאסטר נגטיב אלומיניום במחזיק הגבס כך שחורי העמודים יתיישרו עם החלל המת מול מדפי המשולש. הניחו את המכשיר בין שני סוגרים מקבילים והדקו את הצדדים זה לזה באמצעות חתיכה מלבנית של יריעות סיליקון בעובי 0.5 מילימטר כאטם למניעת דליפה של PDMS נוזלי. במיכל רדוד, ערבבו 0.5 מיליליטר של חומר מרפא PDMS עם חמישה מיליליטר של בסיס אלסטומר PDMS ביחס של אחד עד 10 וערבבו במרץ במשך חמש דקות.

נטרל את תערובת PDMS בתא ואקום תחת ואקום חזק עד שהבועות נעלמות. לאחר מכן, יוצקים את תערובת PDMS על מנגנון היציקה, מילוי יתר כדי להבטיח כיסוי מלא של כל חריץ. הוסף חרוזי זכוכית צבעוניים קטנים לגוף מתלי PDMS שממול לצד עם העמודים לזיהוי ייחודי של כל ארון תקשורת.

הניחו את מנגנון היציקה מפולס אופקית לתוך תא הוואקום תחת ואקום חזק למשך 12 שעות לפחות. אפשרו ל-PDMS להירפא בטמפרטורת החדר, הרחק מאבק, למשך 48 שעות, כדי לאפשר ריפוי מלא וחוזק מרבי של העמודים העדינים. הסר את המהדק, הסוגרים ויריעות הסיליקון ממנגנון היציקה.

באמצעות סכין גילוח מפלדת אל-חלד, חתך את סרט ה-PDMS בחלק העליון של מנגנון היציקה ותומכי המסגרת. השתמש באצבעות כדי להפריד את מתלי PDMS מצידי מחזיק הגבס. הכנס סכין גילוח מפלדת אל-חלד קהה לחלל המת שבין הגבס למחזיק הגבס וחטט אותם זה מזה, כדי להבטיח שה-PDMS הממלא את החלל המת יישאר עם מחזיק הגבס.

לאחר מכן, באמצעות להב נירוסטה חד, חתך את יריעות PDMS הנותרות ואת PDMS החלל המת מקצות העמודים. בעזרת האצבעות, מפרידים באיטיות את מתלה PDMS מהגבס בצד שממול לעמודים. המשיכו להחליף צדדים עד שהעמודים יהיו נקיים מיציקות המאסטר.

שחרר את כל ארונות התקשורת PDMS ואת העמודים כפי שהודגם בעבר, והשתמש בסכין גילוח חד כדי לחתוך את כל עודפי PDMS שנותרו מהמדפים. באמצעות מדפסת תלת-ממד למידול תצהיר התכה תרמופלסטית, הדפס את רכיבי מכשיר הגשש היציב, או SPoT. ודא התאמה מאובטחת למכונת הדפוס בין החלקים המודפסים בתלת-ממד ובין ארונות התקשורת PDMS והג'יג בעל שלושת הראשים.

כמו כן, ודא כי מתלי PDMS מתאימים היטב עם העמודים רק להגיע לתחתית הבארות מבלי להיות כפופים. מערבבים 0.5 מיליליטר של PDMS שחור חלק A עד 0.5 מיליליטר של חלק B בסירת שקילה קטנה, או במיכל רדוד עד שהתמיסה אחידה בצבעה. משחררים את ה-PDMS השחור המעורב בתא ואקום תחת ואקום חזק למשך 20 דקות.

שפכו את ה-PDMS השחור על הבסיס המודפס בתלת-ממד כדי למלא את החורים והקישו כדי להבטיח שלא יישארו בועות. לגרד כמה שיותר PDMS עודף מהבסיס. הצמידו את החתיכה בעלת שלושת השיניים לבסיס והניחו את מתלי ה-PDMS בחריצים שעל הג'יג התלת-ראשי, כדי להבטיח שקצות העמודים ישקעו ב-PDMS השחור בבארות העגולות.

אפשרו ל-PDMS השחור להחלים בטמפרטורת החדר, הרחק מאבק, למשך 48 שעות. החליקו החוצה את החתיכה התלת-ראשית, תוך מזעור המתח על העמודים. בעזרת מלקחיים קטנים, גרדו את סרט ה-PDMS השחור הדק המקיף כל SPoT, ולאחר מכן הכניסו מלקחיים עדינים ומכופפים לבאר ה-SPoT כדי לשחרר אותו מהבסיס המודפס בתלת-ממד.

בדוק את SPoTs וחתוך כל סרט PDMS שחור שנותר מתהליך הליהוק באמצעות מספריים vannas עדינים. ודא שהעמודים המוגמרים הם באורך הנכון על ידי התאמת מתלי PDMS למסגרת הטלפון הסלולרי polys, ולאחר מכן החלקה זו על לוח הבסיס השחור. לאחר autoclaving bioreactor והכנת תערובת התא, להמשיך לייצר hECTs.

לובשים כפפות סטריליות, מוציאים את לוחית הבסיס השחורה מהשקית האוטוקלאבית המכילה את חלקי הביוריאקטור ומניחים אותה בכלי של 60 מיליליטר כשהבארות פונות כלפי מעלה. פיפטה 44 מיקרוליטר של תערובת התא לתוך כל באר לאט כדי למנוע החדרת בועות. לובש זוג כפפות סטריליות טריות, הסר את מסגרת הפוליסולפון עם מתלי PDMS מתיק האוטוקלאב.

הנמיכו את המסגרת ללוח הבסיס כך שקצות המסגרת יתאימו לחריצים בקצה לוח הבסיס. כדי לוודא שהעמודים ישרים לחלוטין והמסגרת אינה מוטה, הכניסו את הביוריאקטור לצלחת של 60 מילימטר. הוסף מיליליטר אחד של 10% FBS במדיום תחזוקת קרדיומיוציטים לצלחת 60 מיליליטר כדי להגביר את הלחות ככל שה- hECTs מתמצקים.

מניחים את התבשיל ללא מכסה בכלי 100 מ"מ בפרופיל גבוה ומכסים אותו במכסה צלחת 100 מ"מ, ואז מחזירים את הביוריאקטור לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לקולגן ליצור ג'ל עם התאים בתרחיף. לאחר שעתיים, מוציאים את המנה מהאינקובטור. הוסף 13 מיליליטר של 10% FBS במדיום תחזוקת קרדיומיוציטים, והטה את הצלחת כדי לאפשר לתווך לזרום בין לוח הבסיס PTFE לבין מתלי PDMS.

בדקו את הביוריאקטור מהצד אם אין בועות אוויר והחזירו את המנה לאינקובטור. אם האוויר נלכד, הטו את הביוריאקטור אל מחוץ לתווך כדי לאפשר לבועה להישבר והורידו אותה שוב באיטיות, או השתמשו במיקרו פיפטה עם קצה העמסת ג'ל כדי לשאוב את האוויר מבלי להפריע לעמודים. בדוק את דחיסת hECT דרך החלון במסגרת.

במשך 24 עד 96 שעות, hECTs קומפקטיים והופכים אטומים יותר. הסר את לוח הבסיס כאשר hECTs נדחסים בלפחות 30% בהשוואה לקוטר המקורי. ממלאים את צלחת ה-60 מ"מ המכילה את הביוריאקטור באמצעי תחזוקת קרדיומיוציטים עד שהנוזל נשטף עם שפת המנה ומוסיפים 14 מיליליטר לצלחת חדשה בקוטר 60 מ"מ.

בעודכם לובשים כפפות סטריליות, הפכו את הביוריאקטור בצלוחית שלו כך שצלחת הבסיס תהיה למעלה. לאחר בדיקת בועות אוויר לכודות, הרימו לאט את צלחת הבסיס ושמרו עליה ישרה. ודא שהטיפים לפוסטים ממוקדים.

הפעל את מתג הסף וכוונן את המחוון עד שה- SPoTs יסומן יפה ואל תשנה צורה כאשר hECT מתכווץ. השתמש בכלי המלבן כדי לצייר מלבן סביב אחד ה- SPoTs, ולחץ על הלחצן הגדר לחצן אחד בתוך תיבת גבולות הפוסט כדי להגדיר את מיקום המלבן סביב ה- SPoT, ולהבטיח שה- SPoT יישאר תמיד בגבול המלבן. חזור על התהליך לפוסט השני והקלט אותו תחת קבוצה שתיים.

התאם את הגדרות גודל האובייקט כדי למנוע מהתוכנית לעקוב אחר אובייקטים קטנים יותר, וודא שמספר האובייקטים שאחריהם מתבצע מעקב בכל מלבן נשאר קבוע. הממשק מציג את המרחק הנמדד בין האובייקטים המסומנים בזמן אמת. השתמש בגרף זה כדי לפקח על הרעש.

תחת כותרת הרץ של תדר הקצב, ציין את טווח התדרים הרצויים ואת המרווח הרצוי לצעד מדקה למקסימום. בתיבות מימין, בחר את זמן ההגדרה הרצוי כדי לאפשר ל- hECT להסתגל לתדר הקצב החדש, ולאחר מכן ציין את זמן ההקלטה ואת מתח הקצב. התחל את התוכנית על ידי לחיצה על כפתור התחל התוכנית.

לאחר רישום נתונים מתדר אחד, הגדל את תדר המגרה במרווח הרצוי להקלטה חדשה עד שתגיע לתדר המרבי. תמונות מייצגות של hECTs מוצגות כאן כפי שהן מוצגות מלמטה, שנוצרו ללא SPoTs ועם SPoTs. ה- SPoTs סיפק צורה מוגדרת יחידה למעקב במהלך רכישת הנתונים.

במקרים קיצוניים אף הוסתר אובייקט המעקב. צורה אמינה יותר לעקיבה אופטית והפחתת רעשים אפשרה מדידה של רקמות חלשות בכוח מפותח נמוך כמו מיקרו ניוטון אחד. ה- SPoTs סיפק גיאומטריית כובע שמנעה את אובדן hECT.

פונקציית hECT שנמדדה הייתה יציבה לאורך זמן תרבית ממושך במערך הקצב הנוכחי עם השלב המחומם. בהשוואה למדידות בטמפרטורה פיזיולוגית, hECTs הראו דינמיקה שונה של התכווצות בטמפרטורת החדר, עם קצב איטי יותר של התכווצות והרפיה. בתדרים גבוהים יותר, hECTs נטו להיות חלשים יותר בטמפרטורת החדר.

בתדרים נמוכים יותר, hECTs נטו להיות חזקים יותר בטמפרטורת החדר. בקצב של 36 מעלות צלזיוס, ל-hECTs היה קצב פעימות ספונטניות גבוה יותר וטווח רחב יותר של תדרי לכידה. הסביבה המבוקרת בטמפרטורה מבטיחה את הרלוונטיות הפיזיולוגית של פונקציית hECTs הנמדדת.

בנוסף, אמבט המדיה המשותף של הביוריאקטור הרב-רקמתי מאפשר מחקרים של איתות פרקריני בין hECTs של הרכבים תאיים שונים. התוספת של SPoTs לביוריאקטור הרב-רקמתי שלנו מאפשרת לחוקרים לחקור ביעילות שריר לב חולה עם מתח גבוה או נמוך באופן חריג, שאחרת היה מחליק מקצות העמודים הלא מכוסים שלנו.