הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

המטרה הכללית של הליך זה היא להנדס מעקפים כלי דם מבוססי ביולוגיה באמצעות מערכת ביו-ריאקטור פולסטילית. דבר זה מושג על ידי הכנת פיגום ביודגדרדל מרשת PGA שבה יגדלו התאים, והרכבתם בתא ביו-ריאקטור. לאחר מכן מזריעים את הפיגומים בתאי שריר חלק, ומכסה עם אטמים לצינורות אוויר והזנה אוטם את תא הביו-ריאקטור.

לאחר מכן, הביוריאקטור מחובר למערכת זרימה כדי לספק זרימה פולסטילית לכלי הדם בביוריאקטור. בתוך הריאקטור, התאים גדלים לכדי כלי דם שעוברים בדיקות אימונוכימיות, ביוכימיות ומכניות. השלכותיה של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלת העורקים הכליליים, שכן טכניקה זו מהווה גישה מבטיחה להנדסה מחדש של שתלי כלי דם בעלי קוטר קטן להסבת עורקים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות בתחום הנדסת כלי הדם, ניתן ליישמה גם על מערכות איברים אחרות החשופות לכוחות פיזיולוגיים מחזוריים. באופן כללי, מי שאינו מכיר את השיטה יתקשה בביצועה. נדרש תרגול רב כדי לשלוט במיומנויות אלו באופן מלא.

הרעיון לגישה זו עלה תחילה כאשר הבנו את החשיבות של הפעלת גירוי מכני פיזיולוגי לצורך רגנרציה של מבנים הנדסיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן תהליכי הביוריאקטור קשים ללמידה בשל ריבוי השלבים בהם, וניתן לרכוש אותם רק באמצעות הדגמה מפורטת. לתחילת הדברים, השתמש במים מזוקקים כדי לנקות קטעים באורך 30 centimeter של צינור סיליקון בעל קוטר פנימי של three millimeter, והשאר אותם להתייבש באוויר.

השתמשו במספריים כדי לגזור מקטע של 1.1 סנטימטר על שמונה סנטימטרים של רשת PGA עבור כל קטע צינור. בעזרת המוסטט, הצמידו את רשת ה-PGA לצינור באמצעות תפר Dexon 6.0, קשרו שלושה קשרים כירורגיים והמשיכו בתפרים בודדים בעזרת המוסטט; הרשת המאובטחת מהווה פיגום PGA. שטפו את הפיגומים על ידי טבילה ראשונית ב-1 molar sodium hydroxide למשך דקה עד שתי דקות, ולאחר מכן בצעו שלוש טבילות במים מזוקקים למשך שתי דקות לכל טבילה. ייבשו אותם בטפיחות בין השטיפות והניחו להם להתייבש באוויר בתוך מ পোশাক מ इथेג למשך 15 דקות לאחר השטיפה השלישית.

לאחר הייבוש, תפרו שרוולי Dacron באורך סנטימטר אחד לכל קצה של הרשת באמצעות שלוש תפרים. השאירו חפיפה של שני עד שלושה מילימטרים של הפיתול והימנעו מניקובו. ודאו שאתם משאירים כ-15 סנטימטרים של חוט תפירה חופשי לשימוש מאוחר יותר בפרוטוקול זה.

כל רכיבי הביוריאקטור והכלים עוברים עיקור באוטוקלאב מראש. ביום שלפני תחילת התרבית בביוריאקטור, יש להרכיב את הביוריאקטור באופן חלקי ולהטביע את רכיבי הביוריאקטור – את הפיגומים (scaffolds), את רשת הסיליקון, את כלי הניתוח וחוט דק שיהיה ארוך מאורך הביוריאקטור – באמבט של 70% ethanol למשך 30 דקות לפחות בזמן שהם טבולים. השתמש בחוט כדי למשוך את צינור הסיליקון דרך זרועות הצד של הריאקטור.

כעת הוציאו את הביוריאקטור וחברו אליו את פיגומי ה-PGA על ידי הידוק טבעות הדקרון מעל שפתי הזכוכית המורחבות. השתמשו בעודף התפר כדי לקשור כל טבעה. לאחר מכן, באמצעות מחברים, חברו את צינורות הסיליקון בצד אחד של הפיגום לזוג אחד של זרועות הביוריאקטור, וחברו את הצינורות בצד השני של הפיגום לשתי הזרועות האחרות.

לאחר התקנת המחברים, משוך אותם מהזרועות הצדדיות ושטוף את הביוראקטור באתנול. השאר את הריאקטור להשריה למשך 10 דקות מכל צד. הנח את הביוראקטור על מספר צלחות פטרי ושטוף אותו בתמיסת תרבית רקמה.

שטפו את המים. באמצעות פיפטה, ודאו כי אתם שוטפים גם את הרשת ואת הצינורות. כעת, הניחו מגנט ערבוב סטרילי בתוך הריאקטור לשימוש עתידי, ויבשו את המערכת למשך לילה במנדף כאשר המפוח פועל וה-UV כבוי מהשלב זה ואילך.

אין להישען מעל הריאקטור, שכן הדבר עלול להוביל לזיהום. במהלך ההכנה, יש לנגב את כל המחברים באלכוהול עד לניקיונם. לפני החיבור, יש לחזק רבים מהמפרקים בעזרת פאראפורם (paraform), אותו יש להשרות ב-70% ethanol לפני היישום. לכן, יש להכין כמות מספקת משני החומרים.

כאמצעי זהירות, הניחו צלחת פטרי סטרילית מעל כל פתח של הביוריאקטור כדי להגן על פיגום ה-PGA שבתוכו מפני מזהמים. כעת התחילו את ההכנה על ידי חיבור פתח ההזרקה לזרוע השלישית שאינה בשימוש בביוריאקטור. לאחר מכן, חברו את שקית ה-IV למערכת הזרימה.

בעזרת סט צינוריות walrus, קשרו את הקצה הכחול קרוב ככל האפשר לצומת ה-Y וסגרו את הצינור בעזרת תפס. חברו את הצינורית האדומה לקצה הרחוק של שקית ה-IV. לאחר מכן, חברו את הצינור הלבן לצד אחד של מערכת הזרימה.

הכנסו ברז סגירה תלת-כיווני למערכת הזרימה. חברו קצה אחד של צינור מתמר הלחץ לברז הסגירה ואת הקצה השני לפתח המרכזי של שקית ה-IV. כעת, כדי למלא חלקית את מערכת הזרימה ולבדוק דליפות, הוסיפו 350 milliliters של PBS ו-1%fungi zone לשקית ה-IV.

בעזרת מזרק של 60 milliliter, לפני או אחרי החיבור למערכת הזרימה, יש לכוון את הברז (stopcock) לשליטה על כיוון הזרימה של ה-PBS וללחוץ על השקית כדי לשטוף את המערכת. ניתן לבצע שלב זה לפני או אחרי קיבוע התאים. כעת ניתן לקבע את התאים בביוריאקטור.

בדוגמה זו, השעו 8 מיליון תאי SM, ששקולים לכשערך של T 75 אחד בנבטות (confluent), ב-1.25 מיליליטר של מצע גידול, וטפטפו אותם באופן אחיד על פיגום ה-PGA, מחבר Dacron אחד לחבר Dacron השני. לאחר הוספת התאים, נגבו את שולי הביוראקטור בעזרת אלכוהול. הימנעו מהשהייה מעל הביו-ראקטור.

בשלב הבא, הרכיבו בזהירות את מכסה פקק הסיליקון. ודאו שחלקו התחתון של המכסה אינו נחשף בעת הוצאתו משקית האוטוקלב או במהלך כל אחד משלבי החיבור הבאים. ראשית, חברו את פתח ההזרקה לצינור ההזנה בחיבור הזכר.

שנית, חברו מסנני PTFE של 0.20 מיקרון לכל אחד משלושת פתחי האוורור. שלישית, אטמו את פתח ההזרקה. הכניסו את מכסה פקק הסיליקון המורכב אל תוך הביוריאקטור מזכוכית.

ודאו שצינור ההזנה אינו נוגע לפיגומים מסוג PGA המונחים במקומם. לאחר מכן, אטמו באמצעות פאראפילם (parafilm). כעת חברו את הביוראקטור למערכת הזרימה והכניסו את הביוראקטור ומערכת הזרימה לתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

במשך 25 עד 30 דקות, יש להניח את הריאקטור על צדו ולסובב אותו בכל חמש דקות. לאחר מכן, בעודו בתוך האינקובטור, מלא את תא הביוריאקטור ב-400 milliliters של מצע גידול four to 10 באמצעות משאבה דרך צינור הזנה. כעת, הדגר את הפיגומים המאוכלסים ללא שאיבה פולסטילית למשך שישה עד שבעה ימים ב-37 degrees Celsius עם 5% carbon dioxide.

אין צורך בהחלפת מצע או בהשלמת ויטמין C במהלך זמן זה. לפני הפעלת המשאבה, יש לבדוק את הצינורות לאיתור דליפות או כיפופים. לאחר מכן, יש לכוונן את קצב המהירות של המשאבה כדי לשמור על טווח לחצים שבין 30- ל-270 millimeters of mercury. יש לנטר ולשמור על לחץ זה מדי יום לאורך כל תקופת התרבית.

יש לבצע החלפת מצע והשלמה של ascorbic acid פעמיים בשבוע בזמן שהפיגום גדל תחת שאיבה פולסטילית להזנת מצע טרי; ראשית, חבר את פתח ההזרקה ואת מסנן ה-PTFE אל מכסי ההזנה לצורכי החלפת המצע ופינוי פסולת המצע. לאחר מכן, הנח את צינור ההזנה בבטחה במשאבה הדו-כיוונית והכנס קצה אחד לפתח ההזנה של הביוראקטור ואת הקצה השני למכסה ההזנה. כעת, התחל לשאוב באיטיות 200 milliliters של מצע.

ניתן להעלות בהדרגה את מהירות המשאבה. לאחר מכן, חברו צינור הזנה חדש והתחילו להזרים לאט 200 milliliters של מצע טרי. כדי להוסיף ascorbic acid לריאקטור, הסירו 25 milliliters של מצע באמצעות מזרק סטרילי של 30 milliliters.

הוסף חמישה מיליליטרים של תמיסת חומצה אסקורבית סטרילית ולאחר מכן החזר את ה-25 מיליליטרים. כלי דם מהונדסים ייראו אטומים ויגיעו לעובי דופן של כ-250 מיקרון לאחר שמונה שבועות של תרבית. בתנאים פולסטיליים, צביעת hematoxylin ו-eosin של כלי דם מהונדסים מראה שינויים במורפולוגיית הרקמה עם הזמן ועם הפולסציה.

הצד הלומנלי של כלי הדם מסומן ב-L בצביעת masson's tri CHRO. עבור קולגן, כלי הדם שקיבלו פולס במשך ארבעה שבועות מראים כמות קולגן רבה יותר מאשר המקבילים להם שלא קיבלו פולס; חצים לבנים מצביעים על שאריות של פרגמנטים של PGA בכלי הדם עד שבוע 12. ניתוח אימונוכימי מראה את הביטוי של סמן השריר החלק המוקדם alpha actin, סמן השריר החלק הבינוני cal poin one והסמן המאוחר של השריר החלק myosin heavy chain. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בשבע עד שמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע את כל השלבים באופן נקי וסטרילי ככל האפשר, בהתאם להנחיות אלו. ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון שינוי של הלומן (lumen) של הכלי הדם ההנדסי, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון חשיבותו של שינוי פני השטח של הלומן בשמירה על כלים דם הנדסיים במהלך מחקרים in vivo, לאחר פיתוחם.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנדסת הרקמות, ובמיוחד הנדסה וסקולרית, לבחון אמצעים פוטנציאליים לטיפול במחלות עורקים כליליים במודלים של בעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג שתלי כלי דם מהונדסים הניתנים להשתלה באמצעות תרבית פוסטלית דינמית. זכרו כי עבודה עם סודיום הידרוקסיד עלולה להיות מסוכנת, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון הגנה על העיניים וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.