הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens
10 בפברואר 2023
כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.
הדמיה בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בשינויים הדינמיים של גדילה והתפתחות ברמה התאית והתת-תאית. פרוטוקול פשוט זה להדמיית קיטועי זמן תלת-ממדיים יכול לחקור ישירות את הדינמיקה של דופן התא לאורך תקופה ארוכה. פרוטוקול זה משתמש בצבע calcofluor כדי לסמן את הדינמיקה של עובי דופן התא, ולכן אינו דורש טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי.
אותות calcofluor הם יציבים והוא יכול להימשך יותר משבוע. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות עם מבנים פשוטים המכילים דפנות תאים והוא יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor כגון בצמחים פורחים. בפרוטוקול זה, אותות הקלקופלור יציבים כאשר צבע זה מעורבב בתווך במהלך כל התהליך של הדמיה בהילוך מהיר.
כדי להתחיל, לפזר את רקמת הטחב בת שבעת הימים לתוך צינור מיקרו 1.5 מיליליטר המכיל 20 מיקרוליטר של מים מעוקרים. עבור סוג פראי להשתמש מלקחיים כדי להפריד את protonemata. עבור מוטציית ggb, יש להפריד את הפרוטונמטה באמצעות פיפטה AP-1000.
מוסיפים 10 מיקרוליטר של הקלקופלור-לבן המעוקר לתוך המיקרו-צינור ומשאירים את הצינור זקוף במכסה המנוע למשך שתי דקות להכתמה. מיד לאחר הצביעה, מערבבים את הצמחים עם 200 מיקרוליטר של BCDATG מקורר המכיל מדיום BCDAT על ידי פיפטינג חמש פעמים עם פיפטה P1000 ומעבירים את התערובת לצלחת בסיס זכוכית 27 מילימטר. ודא כי 200 מיקרוליטר של BCDATG עם דגימות מופץ באופן שווה על פני השטח של צלחת זכוכית 27 מ"מ תחתית כדי לייצר שכבה דקה של סרט כך הדגימות נמצאים במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה.
לאחר התמצקות במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את השכבה הדקה בשלושה מיליליטר של BCDATG מקורר ומניחים לה להתייצב למשך 10 דקות כדי להתמצק שוב. בתחתית המנה מציירים תשעה קווים כל אחד בכיוונים מקבילים ומאונכים ומסמנים את השורות בתווים מא' עד ח', ואת העמודות במספרים מאחת עד שמונה. השתמש בחלק העליון, התחתון, הימני, האמצעי והשמאלי כדי לסמן את המיקומים בתוך כל ריבוע.
לדוגמה, אם צמח נמצא בריבוע בשורה השנייה, בעמודה השישית וממוקם בחלק השמאלי העליון של הריבוע, אז צמח זה מקבל את השם b6 בפינה השמאלית העליונה. הניחו את צלחת תחתית הזכוכית תחת אור לבן למשך יום עד יומיים לפני שתעברו הדמיה בהילוך מהיר מדי יום, למשך עד שלושה ימים. כדי לבנות מחדש את התמונות התלת-ממדיות, פתח את הקובץ ND2 ולחץ על אמצעי אחסון.
לשחזר את דופן התא ביום אפס, ביום הראשון, ביום השלישי וביום הרביעי. לאחר צילום כל תמונה, החזירו את הצלחת מבוססת הזכוכית לתא הגידול. שינויים דינמיים בדפנות הצולבות הודגמו על ידי צביעה לבנה בקלקופלור בסוג פראי, ומוטציות ggb.
עבור מוטציות ggb, קווים מקווקווים לבנים מתחת לכל תמונה מציינים את דופן תא המשטח השבור בתאים המתרחבים, וקווים כתומים מציינים את התאים מתחת לפני השטח של דופן התא ב- ggb. ההבדלים באות הקלקופלור-לבן יכולים להיות מזוהים על מיקומי פני השטח של התאים ואזורים מוכתמים פחות בצפיפות הצביעו על התרחבות תאים במוטציות ggb או באתרי הסתעפות חדשים בסוג הבר. עבור תרבית טרום תרבית מסוג בר, הצמחים באור אדום חלש מלמעלה במשך חמישה ימים נדרשים כדי לעורר את התגובה הפוטוטרופית של פרוטונמטה, כך שניתן יהיה לחבר את הצמחים לתחתית הכלים וניתן יהיה לצאת מהצמחים במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה מכיוון שניתן להשתמש בקלקופלור-לבן עם צבעים אחרים כגון מיקרוספירה.
מידע נוסף על התרחבות התא ניתן גם ללמוד. דינמיקה של דופן תא הצמח היא קריטית לביצוע יעיל של צמיחה והתפתחות, כמו גם לתגובה לאותות סביבתיים. פרוטוקול זה מאפשר חלוקה ישירה של שינויים באותות דופן התא ואינטגרציה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט לדימות בזמן אמת (time-lapse) בתלת-ממד של דינמיקת דופן התא ברקמת טחב חיה. השיטה מאפשרת ויזואליזציה של ניתוק דופן התא במוטציות ggb ושל דפוסי עיבוי בטחב מסוג פראי (wild-type) במהלך התפתחות לאורך תקופה ממושכת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- התפתחות צמחים
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- דימוי במסלול זמן (Time-lapse imaging) הוא חיוני לצפייה בדינמיקה תאית.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של תהליכי גדילה.
- צבע Calcofluor משמש לצביעת דפנות התא ללא צורך בטרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי.
- היציבות של אותות ה-calcofluor משפרת את אמינות הדימוי לאורך זמן.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לצפייה בדינמיקה של הדופן התאי בטחב.
- בחינת הבדלים בהתנהגות הדופן התאי בין מוטנטים של ggb לבין טחב מסוג פראי (wild-type).
- אספקת שיטה שניתן להחיל על מערכות צמחים אחרות בעלות דפנות תאיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימיון time-lapse בתלת-ממד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- שימוש בצבע calcofluor לסימון דינמיקת דופן התא.
- שמירה על אותות calcofluor יציבים לאורך תהליך הדימיון.
- יישום הפרוטוקול במערכות צמחים שונות.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של התנתקות דופן התא במוטציות ggb.
- תצפית על דפוסי עיבוי בטחב מסוג פראי (wild-type).
- הדגמה של ישימות הפרוטוקול למבני צמחים אחרים.
- אישור של אותות calcofluor יציבים לפרקי דימוי ממושכים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לחקר דינמיקת דופן התא.
- התובנות שיירכשו עשויות לשפר את ההבנה של התפתחות הצמח.
- ניתן להתאימה שיטה זו לשימוש במגוון מיני צמחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות Time-lapse בתלת-ממד של דינמיקת דופן התא באמצעות calcofluor ב-Physcomitrium patens מאפשר ויזואליזציה ישירה וכמותית של עיצוב מחדש של דופן התא לאורך תקופות זמן ממושכות ללא צורך בטרנספורמציה גנטית. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובביטחון חיזוי בביולוגיה של דופן התא של צמחים, דבר הקריטי לגילוי מוקדם ותיקוף מטרות בהנדסת תכונות של גידולים ובייצור ביולוגי מבוסס צמחים. היציבות והסתגלות השיטה ממצבות אותה כיכולת שניתנת לשימוש חוזר במערכות מגוונות בעלות דופן תא.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של מנגנוני התרחבות ועיצוב מחדש של דופן התא ברקמות חיות.
- תומך בתיקוף תפקודי של הפרעות גנטיות המשפיעות על שלמות דופן התא.
- מסייע בהגברת הביטחון החזוי בהקצאת מסלולים ותיעדוף מטרות עבור ביוסינתזה של דופן התא בצמחים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק קריאה סטנדרטית וניתנת לשחזור של דינמיקת דופן התא ללא צורך בקווי תאים טרנסגניים.
- מספק פלטי דימוי כמותיים ברזולוציה של זמן, המתאימים לניתוח השוואתי בין גנוטיפים או טיפולים.
- מאפשר הכנה ניתנת להרחבה של מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור זרימות עבודה של סריקה בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם פיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי קורלציה בין דפוסי צביעה של דופן התא לאתרים עתידיים של התרחבות או התבססות.
- תומך ברצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני במערכות ייצור מבוססות צמחים.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי אספקת תובנה מכניסטית לגבי פגמים בדופן התא וההשלכות הפנוטיפיות שלהם.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול דימוי זה משתלב ברצף השלב השגור מהגילוי ועד למחקר הפרה-קליני של דפנות תאי צמחים, ותומך הן במחקרים מונחי-השערה והן במערכי סריקה.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות בנוגע להתרחבות ולשלמות דופן התא ברקמות חיות.
- סריקה: מספקת פלטי דימוג כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: תומכת בהשוואה סטטיסטית של דינמיקת דופן התא בין גנוטיפים ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מסייעת להתאמת סמנים ביולוגיים של דימוג עם תוצאות פנוטיפיות הרלוונטיות לפרודוקטיביות של הצמח.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה למערכות צמחים מגוונות ולהקשרים ניסויים הדורשים ויזואליזציה של דופן התא.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בביולוגיה של דופן התא.
- ערך תפעולי: מציע זרימות עבודה של דימות סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וניתנות לשחזור ללא שינוי גנטי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי אפשור הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות בדופן התא.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות מו"פ מבוססות צמחים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית פלואורסצנציה ובניתוח של דימויי time-lapse.
- נדרשת גישה לצבע calcofluor יציב ולמכשור דימוי תואם.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת הדגימות והדימוי.
- ניתן להתאמה למערכות צמחים שונות עם דפנות תא המתאימות לצביעה ב-calcofluor.
- יש לתקף את יציבות האות ואת משך הדימוי עבור כל מערכת חדשה.
