שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה
25 בספטמבר 2023
אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה להדמיית ציאנובקטריה נימית במישור XY. נעשה שימוש במטריצת אגרוז נקודת התכה נמוכה, המאפשרת רכישת תמונות של חלבונים המעורבים בחלוקה, בכיוון אנכי. לכן, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אורגניזם נימה וסוגים שונים של חלבונים.
בחיידקים, חקר הדינמיקה של חלבוני חלוקת התא דורש אוריינטציה מרחבית של התאים. לדוגמה, במקרה של טבעת Z, המרכיב העיקרי בחלוקת התא החיידקי, כיוון אנכי הוא בסיסי כדי להקליט את כל המבנה במישור XY. בסרטון זה, אנו מפתחים שיטה להשגת אוריינטציה מסוימת זו בציאנובקטריה נימית Anabaena.
Anabaena הוא אורגניזם פוטוסינתטי רב-תאי, וחולק עם חיידקים אחרים את היכולת להשתמש בדיניטרוגן אטמוספרי כמקור חנקן. בהיעדר אלמנט זה, Anabaena להבדיל תאים המתמחים קיבוע חנקן. לכן, הוא מספק מודל מצוין שבו לנתח את הקשר בין חלוקת התא לבין רב תאיות.
ראשית, בחר רכיב divisome נוכח זן ציאנובקטריאל נימה המטרה. לצורך הניסוי יש צורך לבנות מוטציה ציאנובקטריאלית נימית המבטאת את הרכיב הדיוויזום שנבחר המאוחה לחלבון פלואורסצנטי. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במוטציה Anabaena המבטאת FtsZ המאוחה ל- GFP כדוגמה.
ראשית, ליצור תת-תרבית חדשה של המוטנט עם 10 מיליליטר של תרבית בשלב נייח, ו-90 מיליליטר של תווך נוזלי. לאחר מכן לגדל את תרבית התאים החדשה באור קבוע ובטמפרטורה אופטימלית, עד שמגיעים לשלב המעריכי. בדוגמה שלנו, המוטציה גודלה ב-25 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים.
עכשיו לוקחים שני מיליליטר מתרבות הגידול ושמים אותם בצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 2, 500 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, בדוק שכל התאים נמצאים בתחתית הצינור.
היזהר בעת הטיפול בדגימות, כדי למנוע השעיה חוזרת. חממו את תמיסת האגרוז בעלת נקודת ההתכה הנמוכה ב-3% במיקרוגל. חשוב לעשות זאת בפרקי זמן קצרים, ולבדוק את התמיסה עד נוזלית לחלוטין.
ברגע שהוא נמס, מניחים בצד כדי להתקרר. קח את צינורות הצנטריפוגות של השלב הקודם, השליך 1.9 מיליליטר של supernatant, ו להשעות מחדש את התאים בנפח הנותר על ידי pipeting לפחות שלוש פעמים למעלה ולמטה. במקום העבודה שלך, שים את הצינור עם התאים, תמיסת האגרוז המומסת, מזרק של מיליליטר אחד חתוך בקצה, ואזמל עם להב חדש ונקי.
לאחר מכן מערבבים את התאים עם 900 מיקרוליטר של תמיסת 3% agarose על ידי pipetting לפחות שלוש פעמים. חשוב מאוד לוודא כי הפתרון agarose הוא לא חם מדי, אבל נשאר נוזלי. עם זאת, אנו נמנעים מנזק לתאים במהלך תהליך זה.
השלב הבא חייב להיעשות מהר, ולפני הפתרון agarose gelifies. למצוץ את מטריצת agarose מזרק אחד מיליליטר, בזהירות. חשוב להימנע מיצירת בועות בזמן שהדגימה נשאבת.
לאחר מכן, לדגור את המדגם, לשים את המזרק במצב אופקי בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר הדגירה, בזהירות להסיר את המטריצה עם התאים באמצעות הבוכנה במשטח נקי ושטוח. באמצעות אזמל, לחתוך את מדגם ג'ל לפרוסות דקות ככל האפשר, שמירה על שלמות המטריצה.
לאחר מכן הפקידו את הדגימות בתלוש הכיסוי המתאים, זו לצד זו. כפי שמוצג בסרטון, בשלב זה, תוכל להשתמש בעצה כדי לסייע בתהליך הטיפול בדגימה. עבור ניסויים בהילוך מהיר, מומלץ להשתמש בתא תא המיועד לניתוח מיקרוסקופיה.
במקרה זה, אנו משתמשים בכיסויים עגולים המתאימים לתאים מסוג זה, כפי שניתן לראות בסרטון. לבסוף, כדי למנוע התייבשות של הדגימה, להוסיף נפח נוסף של תמיסת 3% agarose מומס בתוך החדר. לפני ההדמיה, המתן עד agarose הוא gelified לחלוטין.
עכשיו לשים את החדר עם התאים במיקרוסקופ להדמיה. מומלץ להשתמש בציוד עם בקרת טמפרטורה ולחות. דמיינו את הדגימה בשדה בהיר עם הגדלה מרבית, וחפשו חוט להט בכיוון אנכי.
ניתן למצוא את אתר החלוקה המעניין בסריקה ראשונית באמצעות האות האוטופלואורסצנטי לאורך מישור Z. עם זאת, השתמש בפרמטרים של סמן החלבון הפלואורסצנטי שלך כדי לדמיין את האות של החלבון שלך של עניין באתר החלוקה. כעת ניתן לבצע ניסויים בהילוך מהיר על פי המודל הביולוגי והחלבון המעניין.
במקרה זה, אנו יכולים לראות את כל המבנה של טבעת Z במוטציה FtsZ-GFP, במישור XY. בעזרת השיטה שלנו, היינו מסוגלים להקליט את הדינמיקה של הטבעות האלה בפרק זמן ארוך. לבסוף, עם השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות, אנו מסיקים כי מבנה זה הוא דינמי מאוד במודל שלנו.
שיטה זו היא פרוטוקול מהיר וזול לרישום דינמיקת החלבונים באתר החלוקה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המיושם על מורפולוגיות מורכבות כציאנובקטריה נימה, תוך שימוש באנבאנה כמודל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית להדמיה של ציאנובקטריה חוטית anabaena בעמידה, המאפשרת תצפית מפורטת על חלבוני חלוקת התא, ובמיוחד על מבנה ה-Z-ring. באמצעות שימוש בציאנובקטריה Anabaena כמודל, מדגימה השיטה כיצד להחיל ביעילות סמנים פלורסצנטיים כדי לחקור דינמיקה בצורות רב-תאיות מורכבות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- חלוקת תאים
- ביולוגיה של ציאנובקטריה
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- Anabaena הם אורגניזמים פוטוסינתטיים רב-תאיים המסוגלים לקיבוע חנקן.
- הבנת הדינמיקה של חלבונים בציאנובקטריה יכולה לספק תובנות לגבי חלוקת תאים ורב-תאיות.
- אוריינטציה מרחבית בדימוג היא קריטית ללכידה של מבנים שלמים כגון ה-Z-ring.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- סימון של רכיב הדיביזום FtsZ באמצעות חלבון פלואורסצנטי
- מערכת מודל של ציאנובקטריה פילמנטית (Anabaena)
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לצילום
תוצאות עיקריות
- דינמיקת המבנה של טבעת ה-Z הודגמה בהצלחה במישור XY.
- השיטה הפגינה רזולוציה זמנית גבוהה ואפשרה תצפית רציפה בהתנהגות החלבון.
- התוצאות אישרו את אופיה הדינמי של טבעת ה-Z במהלך חלוקת התא.
מסקנות
- שיטה זו מקלה על חקר הדינמיקה של חלבונים באורגניזמים פילמנטריים ומספקת מסגרת שניתן להחיל על מינים פילמנטריים שונים.
- הממצאים תורמים להבנה רחבה יותר בביולוגיה של התא ובמתודולוגיות של מיקרוסקופיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך מנהלים
דימיון ברזולוציה גבוהה בשיטת time-lapse של דינמיקה של חלבונים במערכות חיידקיות מורכבות הוא קריטי להפחתת סיכונים בשלבי הגילוי המוקדמים ולאימות מטרות הקשורות לחלוקה. שיטת הקיבוע האנכי עבור ציאנובקטריות פילמנטריות מאפשרת ויזואליזציה ישירה של הרכבת טבעת Z והדינמיקה שלה, ובכך תומכת בביטחון חיזוי במחקרים מכניסטיים. יכולת זו מחזקת את הגשר התרגומי מביולוגיה בסיסית של התא לתיקי פיתוח של הנדסה מיקרוביאלית ישומית וביולוגיה סינתטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של דינמיקת חלבוני חלוקת התא במודלים בקטריאליים רב-תאיים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי ויזואליזציה של היווצרות והתנהגות טבעת ה-Z של FtsZ ב-in vivo.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות הקשורות לחלוקה בזנים שעברו הנדסה גנטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין דגימות ביולוגיות מאושרות המכוונות אנכית עבור תהליכי דימות כמותי.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה באמצעות סטנדרטיזציה של כיוון הדגימה ותנאי הדימות.
- מאפשר קריאות Time-lapse חסונות לסריקה של תרכובות מווסתות חלוקה במורפולוגיות מורכבות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תוצרי הדימיון למערכות חיידקים רב-תאיות בעלות רלוונטיות למחלה או רלוונטיות תעשייתית.
- מספק רצף מגילוי מנגנוני ליישומים של הנדסה מיקרוביאלית פרה-קלינית.
- תומך בקידום מותאם-סיכונים של זנים מהונדסים לשימוש בביוטכנולוגיה.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
פרוטוקול קיבוע אנכי זה מתאים לממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח הבדיקה, ומאפשר דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) החל משלב תיקוף המטרה ועד להערכה במודלים מיקרוביאליים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקוד חלבוני חלוקה וארגון מרחבי בחיידקים רב-תאיים.
- סריקה: מספק הכנת דגימות סטנדרטית וניתנת לשחזור עבור בדיקות דימות כמותיות.
- אנליטיקה: מספק מדידות פלואורסצנציה כמותיות עם רזולוציית זמן של דינמיקת חלבונים באתרי חלוקה.
- מחקר תרגומי: מגשר בין תובנות מנגנוניות לתהליכי עבודה של הנדסה מיקרוביאלית פרה-קלינית וביולוגיה סינתטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע שיטה ניתנת להרחבה ובעלות נמוכה, הניתנת להתאמה למערכות מגוונות של חיידקים פילמנטריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתפקוד חלבוני חלוקה ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי דימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין פרויקטים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go עבור יוזמות בהנדסה מיקרוביאלית וביולוגיה סינתטית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של התערבויות המכוונות לחלוקה ושל זנים מהונדסים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובנדסת חלבונים פלואורסצנטיים.
- נדרשת גישה לפלטפורמות דימוג עם בקרה על טמפרטורה ולחות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת הדגימות והדימוג.
- ניתן להתאימה למודלים שונים של חיידקים פילמנטריים באמצעות כלים גנטיים מתאימים.
- אוריינטציית הדגימה והטיפול בה הם קריטיים לקבלת תוצרי דימוג בעלי תוכן גבוה (high-content) הניתנים לשחזור.
