מעקב אחר הדינמיקה של וריאנטים מבניים באוכלוסיות שהתפתחו בניסוי
3 בפברואר 2023
פיתחנו שיטה חסכונית לעקוב אחר דינמיקת אלל פולימורפיזם של נוקלאוטידים שאינם יחידים, שניתן להתאים בקלות לארכיונים קפואים של אבולוציה ניסיונית. טכניקת PCR משולשת שולבה עם אלקטרופורזה אוטומטית מקבילית של נימים כדי לכמת את התדירות היחסית של אלל החדרה במהלך האבולוציה הניסויית.
וריאנטים מבניים כגון החדרות, מחיקות, כפילויות והיפוכים היו בעבר קשים יותר למעקב ניסיוני, ולא ניתן למדוד במדויק את התדרים שלהם על ידי ריצוף אמפליקון. כאן אנו מספקים טכניקה פשוטה וחסכונית, אשר משלבת עיצוב פריימר משולש ואלקטרופרזה נימית מקבילית כדי לעקוב אחר תדרי אלל משתנים מבניים לאורך זמן. שיטה זו נועדה להשלים את ריצוף נקודות הקצה באבולוציה הניסויית ולשחזר את התדרים של אללי דה נובו מתפתחים.
אנו מקווים ששיטה זו תועיל גם לאלה העובדים עם נתוני פתוגן תוך מארחים. מי שתדגים את ההליך תהיה ז'אן המט, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו. השלבים השונים של השיטות יוצגו במקרה שבו האלל הנגזר נובע מהחדרת IS10 לגן חיידקי הנקרא mutS.
ראשית, תכננו זוג פריימרים כדי להגביר אמפליקון קצר על האלל מסוג פרא סביב אתר החדרת המוטנטים. עצבו פריימר פריימר שלישי קדימה שניים בתוך רצף ההחדרה כדי ליצור משתנה גודל קל ממגבר הסוג הפראי. התחילו בחילוץ דנ"א מתרביות של 24 שעות ביממה של שיבוטים קבועים של אללים מסוג בר ומוטנטי.
לאחר כימות הדנ"א, מדללים כל תמצית דנ"א לחמישה ננוגרם למיקרוליטר עם מים. תקן את שתי הדגימות ביחס של 50/50. הגדר תגובה של 20 מיקרוליטר המכילה 10 ננוגרם של דגימת DNA, פריימרים ותערובת מאסטר PCR.
לאחר מכן, להפריד את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה, באמצעות ג'ל agarose 2%. יש לאמת את הבדלי הגודל בין האמפליקונים מהסוג הפראי לבין המוטציה על הג'ל. כדי לקבל עקומת כיול, התחילו בערבוב הדנ"א הפראי והדנ"א המוטנטי ביחסים שונים.
לדלל את מוצרי PCR לריכוז של 0.1 ננוגרם למיקרוליטר. להכנת ג'ל ההפרדה, מערבבים את הג'ל הטרי והצבע. החלף את מאגר הכניסה.
מקם את חיץ השטיפה במיקום המגירה הנכון של מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקביל. הוסף 22 מיקרוליטר של סמן מדלל לבארות של צלחת באר 96. עכשיו להוסיף שני מיקרוליטר של מוצרי PCR מדולל לכל מדגם היטב.
לאחד ובכן, להוסיף סולם גודל DNA מתוך ערכת רגישות גבוהה, החל אחד עד 6, 000 זוגות בסיס בגודל. מקם את צלחת המיקרו במכשיר אלקטרופורזה נימית מקבילה בהפעלה נבחרת על תוכנת המכשיר. נתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.
ראשית, זהה את הפסגות על פי גודלן הידוע. כמת כל אמפליקון כדי ליצור עקומת כיול. לבסוף, ודא כי הכמויות היחסיות של שני האללים נמדדות כראוי.
עקומת כיול זו משמשת לאחר מכן לחישוב כמות הווריאנטים המבניים לאחר הגברת PCR ואלקטרופורזה נימית מקבילית. תוצאות מייצגות אלה עוקבות אחר החדרה משבשת של הגן mutS. Knockdowns ו-mutS מובילים לפנוטיפ היפר-מוטטור, המאפשר לחיידקים לדגום יותר מוטציות משיעור המוטציות הבסיסי שלהם.
באמצעות השיטה שהוצגה, בוצע מעקב אחר תדירות הווריאנטים המבניים mutS לאורך 1000 דורות. נחשף מסלול לא מונוטוני של האלל המוטנטי המתהווה. האלל המוטנטי זוהה לראשונה בדור 680.
לאחר מכן האלל עלה במהירות בתדירותו, והגיע ל-67% בדור 713. עלייה זו קפאה על שמריה, וגדלה רק ב-10% במהלך 53 הדורות הבאים, ל-76%באופן בלתי צפוי, תדירות האלל המוטנטי ירדה אז מ-76% ל-49% במהלך 13 דורות, ולאחר מכן היא עלתה לקיבוע. שיטה זו תועיל לאלה העובדים על אבולוציה ניסיונית.
פרוטוקול זה מאפשר למשתמש לקחת ארכיונים קפואים ולחקור מסלולים אבולוציוניים שאחרת לא ניתן לצפות בהם עם נתוני ריצוף נקודות קצה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשה וחסכונית למעקב אחר הדינמיקה של אללים עם וריאנטים מבניים, ובייחוד השמרות (insertions), במהלך אבולוציה ניסויית. באמצעות שילוב של תכנון פריימרים משולשים עם אלקטרופורזה קפילרית מקבילית, הטכניקה יכולה לחשוף שינויים בתדירות האללים לאורך זמן, ובכך להוכיח את יעילותה בחקר מסלולי אבולוציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- גנטיקה
- אבולוציה ניסויית
- וריאנטים מבניים
רקע
- היה מאתגר לכמת וריאנטים מבניים באמצעות שיטות קונבנציונליות.
- הגברה ומדידה של תדרי אלל של הכנסה (insertion allele frequencies) הן קריטיות להבנת תפקידם באבולוציה.
- השיטה נועדה להוות השלמה לטכניקות ריצוף קיימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת Triplet PCR בשילוב עם אלקטרופורזה קפילרית מקבילית אוטומטית
- מערכת מודל חיידקית (גן mutS)
- הערכה כמותית של תדרירים של אללים
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחר מסלול לא-מונוטוני של אלל mutS לאורך 1000 דורות.
- חשיפת דינמיקה מורכבת שבה תדירות המוטציה עלתה בתחילה, ולאחר מכן ירדה לפני הקיבוע.
- הדגמת יישום בניתוח דגימות קפואות מקובעות למחקרי אבולוציה.
מסקנות
- המחקר מציג שיטה חסונה לצפייה בדינמיקה של וריאנטים מבניים שאינם מזוהים בדרך כלל על ידי ריצוף של נקודת סיום.
- גישה זו מציעה השלכות משמעותיות עבור חוקרים הלומדים אבולוציה ניסויית ודינמיקה של פתוגנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
כימות הדינמיקה של אללה של וריאנטים מבניים (SV) הוא קריטי להבנת ההסתגלות הגנטית והגיוון הפנוטיפי באוכלוסיות של מיקרובים ופתוגנים. שיטה זו מאפשרת מעקב מדויק וחסכוני אחר תדירויות של SV, ובכך היא נותנת מענה לפער מרכזי בשלב הגילוי של הגנומיקה ותומכת בביטחון ניבוי במחקרים תפקודיים המונחים על ידי וריאנטים. היכולת שלה להתרחבות (scalability) והתאימות שלה לדגימות מאוגדות מציבות אותה ככלי בעל ערך עבור תהליכי גילוי מוקדמים ומסלולי מחקר תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מעקב כמותי של תדרי אללים של SV להבהרת פנוטיפים המונעים על ידי וריאנטים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות ניטור הופעת אללים de novo באוכלוסיות מתפתחות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת מסלולי וריאנטים שאינם מונוטוניים לאורך זמן.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות ביולוגיות מאושרות לסריקה המשכית על ידי כימות של SVs בדגימות מאוחדות.
- מנ 표준ת את זיהוי ה-SVs באמצעות תכנון פריימרים הניתן לשחזור ותוצאות של אלקטרופורזה קפילרית.
- מאפשר ניתוח מקבילי וניתן להרחבה המתאים לזרימות עבודה של סריקת וריאנטים בסריקה רב-עין (high-throughput).
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- מתואם עם מערכות רלוונטיות למחלות על ידי כך שמאפשר כימות SV באוכלוסיות של פתוגנים בתוך המארח.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מעקב אחר דינמיקת וריאנטים בדגימות מאורכבות.
- מספק ערך חיזוי להחלטות קידום מותאמות סיכון במחקר מיקרוביאלי ובמחקר פתוגנים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות למעקב דינמי אחר SV, החל מבדיקת השערות מוקדמת ועד למחקר תרגומי, ובמיוחד במערכות מיקרוביאליות ובמערכות של פתוגנים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור נתיבים באמצעות כימות של SVs המופיעים.
- סריקה: מספקת מדידות SV כמותיות וניתנות לשחזור לצורך מוכנות של הבדיקה.
- אנליטיקה: מספקת כימות מבוסס כיול וניתוח השוואתי של תדירויות אללים.
- מחקר תרגומי: מאפשר מעקב אחר SV באוכלוסיות טבעיות ובתוך מאכסן, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה יעילה כלכלית ובת applicability רחבה לכימות SV בפרויקטים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים המונעים על ידי SV.
- ערך תפעולי: מספק כימות SV סטנדרטי, ניתן להרחבה וניתן לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי הבהרה מוקדמת של השפעת הווריאנט.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדופה מותאמת סיכונים של מטרות ומודלים הקשורים ל-SV.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון פריימרים ובתפעול מכשירים לאלקטרופורזה קפילרית.
- נדרש גישה לאלקטרופורזה קפילרית מקבילית ותוכנה לניתוח כמותי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי כיול ונורמליזציה.
- ניתן להתאמה לסוגי SV שונים ולהקשרי דגימות מאוחדות (pooled samples) באמצעות סטים מתאימים של פריימרים.
- מוגבל על ידי הדרישה להבדלים גלויים בגודל האמפליקון ודיוק הכיול.
