מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים
30 ביוני 2023
כאן אנו מציגים את היישום של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כשיטה פשוטה ומהירה לאפיון חיידקים ומנתחים פרטים כגון גודל וצורת החיידקים, ביופילמים של תרבית חיידקים ופעילות ננו-חלקיקים כקוטלי חיידקים.
פרוטוקול זה מראה את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי במצב מגע כדי לצפות בשינויים במורפולוגיה של התא עקב מחלה או טיפול ספציפיים. מומלץ מאוד להשתמש במיכלים אטומים להליך זה כדי למנוע זיהום ולנתח את המדגם הקבוע בהקדם האפשרי כדי למנוע הזדקנות. התחל על ידי קיבוע הדגימות בשקופית על ידי העברה עדינה של המגלשה מעל להבה מספר פעמים עד שהדגימה יבשה.
מניחים את הדגימות הקבועות בצלוחית פטרי ומעבירים אותן לציוד מיקרוסקופ הכוח האטומי לתצפית. לאחר מכן, הפעל את המחשב ואת מיקרוסקופ הכוח האטומי. לאחר מכן בחר את מצב איש הקשר, בדיקות ContAI-G ואפשרויות שיפוע אוטומטי בתוכנה.
הגדר את ערכי ברירת המחדל עבור בקר Z על ידי הגדרת נקודת ההגדרה ל- 20 ננומטר, רווח P ב- 10, 000, רווח I ב- 1, 000, רווח D באפס ומתח קצה לאפס מיליוולט. באמצעות ראש טווח סריקה של 70 מיקרומטר, מקם את הדגימות במצב מגע AFM. קבל תצוגה מהירה של פני השטח מתחת לגשושית באמצעות מצלמה המורכבת על שתי עדשות המשולבות בראש הסריקה.
עכשיו, בחר את האזור הרצוי על ידי עקירה ידנית אותו במישור XY. אפשר לגשושית להתקרב אלקטרונית למשטח הדגימה עד שתגיע למגע. התאם אלקטרונית את מישור המדידה XY של הסורק ומשטח הדגימה על-ידי הפחתת כיוון שיפוע XY.
הגדר את הפרמטרים הסטנדרטיים של התוכנה לקו אחד לשנייה ו 256 נקודות לשורה. לאחר מכן בצע טווח סריקה מלא של שטח של 70 על 70 מיקרומטר. בחרו באזור הקטן יותר בעזרת הכלי זום.
בחר אזור חדש מהדגימה על-ידי משיכת המגן באופן אלקטרוני והזזת הדגימה לאורך מישור XY. לאחר מכן בצע סריקה חדשה כפי שהודגם בעבר. לאחר מכן, השתמש בפילוס שורה אחר שורה בתפריט הכלים של התמונה בבחירת המסנן כדי לבצע עיבוד נתונים.
מטבו את הגובה המרבי והמינימלי בסרגל הצבע לקבלת רזולוציית התמונה הטובה ביותר. לבסוף, בצע את ניתוח התמונה באמצעות תפריט הניתוח. בחר את הנקודות הראשוניות והסופיות בעזרת הכלי הרצוי כדי לקבוע את האורך והמרחק.
ניתוח מיקרוסקופי של כוח אטומי של תרביות החיידקים הראה כי תרביות Staphylococcus aureus התפזרו לפי אזורים עם אגרגטים קוקוס. סולמות מוגברים הראו שיש הערכה גדולה יותר של התפלגות האוכלוסייה ומורפולוגיה של קוקוס. תמונות מצב המגע AFM אפשרו לקבוע את גודל הקוקוס שהראה רוחב ממוצע של 1.25 מיקרומטר.
Pseudomonas hunanensis הראה פיזור הומוגני על כל משטח התמיכה בזכוכית ויצר חד-שכבה דבקה. התרביות היו בצורת מוט באורך של 1.9 מיקרומטר וברוחב של 0.9 מיקרומטר. חשיפה לדילול מיקרו של ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום של סטפילוקוקוס זהוב גרמה לאובדן משטח חלק וקווי מתאר הומוגניים עקב הידרדרות חמורה במבנה התאים.
היווצרות שלפוחית ושחרור חומר ציטוסולי נצפו בתרביות בריכוזים גבוהים יותר מאשר המיקרופון. תוצאות דומות התקבלו בתרביות E.coli, כאשר הבקרות הראו משטחים חלקים המדגישים את צורתו ההומוגנית דמוית המוט. המבנה נעלם לחלוטין בחשיפה של 1, 000 PPM לננו-חלקיקים עם צלליות מובחנות בלבד.
חשוב לבצע תיקון מדגם כראוי כפי שהוא חיוני לניתוח נוסף. מסנן התמונה מסייע לספק רזולוציית תמונה טובה ופרטים לדוגמה. באמצעות שיטת התיקון, ניתן ליישם מצבי AFM ללא מגע שיכולים להיות מועילים בחקר תכונות מכניות.
מתודולוגיה זו יכולה להיות כלי זול ושימושי למחקר רפואי ומיקרוביולוגי המתמקד בניתוח נזק לתאי חיידקים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עושה שימוש במיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) לאפיון מפורט של חיידקים, תוך התמקדות בגודל החיידקים, צורתם, ביופילמים של תרביות וההשפעות הבקטריצידיות של ננו-חלקיקים. הפרוטוקול מדגיש הכנה קפדנית של הדגימות וטכניקות דימוי ספציפיות לצורך תצפית בשינויים מורפולוגיים בתאי חיידקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- מיקרוביולוגיה
- אפיון בקטריאלי
- מחקר ננו-חלקיקים
רקע
- מיקרוסקופיית כוח אטומי היא כלי חשוב לצפייה במורפולוגיה של חיידקים.
- הבנת התהליך של היווצרות ביופילם חיידקי ותגובתו לחומרי קוטל חיידקים מסייעת למחקר רפואי.
- הכנת הדגימות היא קריטית לצורך דימות וניתוח מדויקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) במצב מגע
- תרביתי של Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas hunanensis
- בדיקות חשיפה לננו-חלקיקים
תוצאות עיקריות
- ניתוח AFM חשף את הגודל והפיזור של התאים הבקטריאליים, כאשר Staphylococcus aureus הראה רוחב ממוצע של 1.25 מיקרומטרים.
- ריכוזים מוגברים של ננו-חלקיקי מגנזיום אוקסיד הובילו לשינויים מורפולוגיים משמעותיים בתאי חיידקים.
- המחקר מדגים את יעילותו של ה-AFM לניתוח השלמות המבנית של חיידקים.
מסקנות
- מתודולוגיה זו מדגישה את התועלת של AFM במיקרוביולוגיה, ובמיוחד בהערכת נזק חיידקי.
- הממצאים תורמים להבנה רחבה יותר של תגובות חיידקים לטיפולים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) במצב מגע מאפשרת הערכה מורפולוגית מהירה וברזולוציה גבוהה של תאי בקטריה, ובכך תומכת בהערכה בשלבים מוקדמים של התערבויות אנטימיקרוביאליות. טכניקה זו מספקת נתוני טופוגרפיה תלת-ממדית ונתוני נזק תאי יישומיים ללא המורכבות או העלות של מיקרוסקופיה אלקטרונית, ובכך מקלה על סריקה יעילה של השפעות ננו-חלקיקים על שלמות הבקטריה. הפשטות התפעולית של ה-AFM והפלט הכמותי שלו ממצבים אותו ככלי בעל ערך להפחתת סיכונים מכניסטיים ולאישוש מטרות במסלולי פיתוח של תרופות אנטי-אינפקטיביות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של מורפולוגיית תאי חיידקים ושינויים מבניים בעקבות חשיפה לתרכובת.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות כימות נזקים לתאים ושיבושים מורפולוגיים ברמה הננומטרית.
- מסייע בבדיקה מהירה של היפותזות בנוגע למנגנוני פעולה אנטימיקרוביאליים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מספק נתונים טופוגרפיים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה ותיקוף של הבדיקה.
- מאיץ את סריקת ספריות של ננו-חלקיקים או תרכובות לבחינת השפעות בקטריצידיות.
- מספק פלטי דימוג בעלי תוכן גבוה המתאימים לאנליזות השוואתיות המשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מדדים מורפולוגיים לסמנים ביולוגיים תרגומיים של שלמות התא החיידקי.
- מאפשרת רציפות משלב הגילוי in vitro ועד לאישור פרה-קליני של מועמדים לאנטימיקרוביאלים.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת ראיות חסונות להשפעה התאית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
מצב מגע ב-AFM משתלב ברצף המחקרי מהגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית מוקדמת של נזק למורפולוגיה ולתאי חיידקים בתגובה להתערבויות מועמדות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהערכה מונחית-השערה של מנגנונים אנטימיקרוביאליים ומטרות תאיות.
- סריקה: מספקת נתוני דימות סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך מיון ותיעוד של תרכובות.
- אנליזה: מספקת מדידות כמותיות של גודל תאים, שלמות פני השטח והפרעה מורפולוגית.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים על ידי התאמת נקודות קצה מורפולוגיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה וכלכלית לשימוש חוזר במגוון זנקים חיידקיים ומחלקי תרכובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ביעילות אנטימיקרוביאלית ובמחקרים של מנגנוני פעולה.
- ערך תפעולי: מקטין זמן ועלויות בהשוואה למיקרוסקופיה אלקטרונית, תוך שמירה על פלטים ברזולוציה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך תהליך הפיתוח (go/no-go) באמצעות אספקת ראיות כמותיות חזקות להשפעה התאית.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים לאנטימיקרוביאליים בהתבסס על ראיות מורפולוגיות ישירות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהפעלת AFM ובהכנת דגימות כדי להבטיח את איכות הנתונים.
- נדרשת גישה למכשור AFM בעל יכולת למצב מגע (contact mode) וגשים מתאימים.
- נדרשים פרוטוקולים סטנדרטיים לקיבוע דגימות ולדימוי כדי להבטיח הדירות בין צוותים שונים.
- ניתן להתאים את השיטה לזני பாகטרያዎች ולסוגי ננו-חלקיקים שונים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- יש למזער את הזדקנות הדגימה ואת הזיהום כדי לשמר את השלמות המורפולוגית לצורך הניתוח.
