ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית באמצעות סימולציה למידה מבוקרת
3 במרץ 2023
מאמר זה מסביר כיצד להשתמש בלמידת מכונה בפיקוח סימולציה לניתוח מורפולוגיה של מיטוכונדריה בתמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים קבועים.
אנו מדגימים את השימוש בכלי למידת מכונה בפיקוח סימולציה לניתוח מיטוכונדריה בתמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים קבועים. השיטות הנוכחיות לפלח מיטוכונדריה בתמונות מיקרוסקופיה כוללות שיטות אוטומטיות מבוססות סף כגון Ostu או סגמנטציה ידנית. טכניקות מבוססות סף מתפקדות בצורה גרועה כאשר יחס האות לרקע נמוך.
בדרך כלל, תמונות לניתוח המורפולוגי כוללות מספר רב של מיטוכונדריה, מה שהופך את הפילוח הידני למייגע. שיטות למידה עמוקה מפוקחות מבצעות סגמנטציה בדיוק גבוה, אך דורשות מספר רב של נתוני זוגות קרקע-אמת לצורך אימון. גישה זו משתמשת בסימולטור מבוסס פיזיקה כדי ליצור זוגות של תמונות מיקרוסקופיה, ואת מסכת הצורה הדו-ממדית שלהם של אמת הקרקע, ובכך מבטלת את הצורך בביאור ידני.
המודל המאומן על תמונות מדומות משמש לאחר מכן כדי לפלח את המיטוכונדריה בתמונות מיקרוסקופ אמיתיות. אנו משתמשים בכלי פילוח מבוסס למידה עמוקה המאפשר אוטומציה של משימה זו בדיוק גבוה ושאינו דורש מערך נתונים מבואר של אמת קרקעית לצורך אימון. הסימולציה מתחילה ביצירת גיאומטריה באמצעות עקומות פרמטריות ליצירת צורה.
פולטים מתפלגים באופן אחיד וממוקמים באופן אקראי על פני השטח של הצורה שנוצרה, כך שהצפיפות תואמת לערכים ניסיוניים. PSF תלת-ממדי של המיקרוסקופ מחושב באמצעות מודל גיבסון-לאני. כדי להשיג פוטו-ריאליזם בין התמונות המדומות לבין התמונות הניסיוניות, אנו מחקים הן את הרעשים הכהים והן את רעשי הצילום.
אמת הקרקע הפיזיקלית נוצרת בצורה של מפה בינארית. אנו מעריכים את ההשפעה של טיפול CCCP על מורפולוגיה של מיטוכונדריה של קרדיומיובלסטים קבועים המצולמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. תרבית תאים.
התכוננו לזריעת התאים, הפועלים במכסה זרימה למינרית סטרילית, על ידי הנחת כיסוי לכל תנאי ניסוי בבאר של צלחת 12 באר. ודא שמתלה התא המדולל מעורבב כראוי על ידי העברת תכולת צינור הצנטריפוגה למעלה ולמטה מספר פעמים לפני חלוקת הנפח המתאים לכל באר. הליך ניסיוני.
שאפו מדיה של תרבית תאים מהבארות של צלחת 12 הקידוחים ולאחר מכן מרחו במהירות מדיה טרייה שחוממה מראש על בארות הבקרה ועל המדיה המחוממת מראש עם 10 תמיסת CCCP מיקרומולרית על בארות מצב הבדיקה. לדגור באינקובטור התאים 37 צלזיוס במשך שעתיים. שאפו את מדיית תרבית התאים מהבארות והחלו את פתרון הקיבוע שחומם מראש.
צביעה והרכבה של תאים על תלושי כיסוי. הוסף מדיה להרכבה של 10 מיקרוליטר למגלשת זכוכית מוכנה כדי להרכיב תלוש כיסוי. הרימו את מחליק הכיסוי מ-12 לוחות הבאר באמצעות פינצטה וטפחו לחות ממחליקות הכיסוי על ידי נגיעה קצרה בקצה ובגב הכיסוי להחליק אל מגבת הנייר המוכנה ללא מוך.
הנמיכו בעדינות את הכיסוי והחליקו מטה על טיפת המדיה הממתינה. מיקרוסקופ והדמיה. באמצעות העיניים, כוונן ידנית את רמת Z כדי שהדגימה תהיה ממוקדת.
עבור לכרטיסייה שנרכשה בתוך התוכנה. השתמש בהגדרה החכמה כדי לבחור ערוץ פלואורסצנטי שישמש להדמיה. מערך ממורכז במרכז הכיסוי עם 12 מיקומים בסך הכל לצילום.
מיקום RA במרכז החלק המרכזי של הכיסוי. ניתן לצלם מספר מיקומים באופן אוטומטי. הפקת נתוני אימון מדומים.
הורד את הקוד ופתח את התוכן. בצע את ההוראות וקרא כדי להגדיר את הסביבה. נווט אל התיקיה בשם src"צור עותק או השתמש בתיקיה 2.
סימולציית מיטוכונדריה אוורירית"ו לשנות את שמה. תיקייה זו מכילה את כל הקבצים הקשורים לסימולציה של נתוני האימון. ישנן שלוש קבוצות של פרמטרים שיש להגדיר עבור הסימולציה.
ראשית, הגדר את הפרמטרים של מספר המיטוכונדריה, טווח הקוטר, הטווח של ציר Z וצפיפות הפלואורופורים עבור הסימולטור בקובץ תצורת האצווה. לאחר מכן, הגדר פרמטרים אופטיים של צמצם מספרי, הגדלה ואורך גל מינימלי של ערכת הנתונים במיקרוסקופPSFmode הקובץ. py"הגדר את הערך הרצוי עבור גודל פיקסלים ואורך גל פליטה generate_batch_parallel האש.
py"הגדר את קבוצת הפרמטרים השלישית לגבי ערכת נתוני הפלט, כגון גודל תמונות הפלט, מספר האריחים בכל תמונה ומספר התמונות הכולל בקובץ generate_batch_parallel. py"הפעל את הקובץ generate_batch_parallel. py"כדי להתחיל את הסימולציה.
כדי לקבל את התמונה בגודל הסופי, צור עותק של התיקיה בשם 5. הכנת נתונים והדרכה/הכנת נתונים"וניווט לתוכו. הגדר את הפרמטרים של מספר האצווה ומספר התמונות לכל אצווה, טווח הרעש שיתווסף בקובץ Data_generator.
py"הפעל את הקובץ Data_generator. py"צור את תמונות המונטאז'. העתק את התיקיות בשם image"and segment" לתיקיית datatrain/train".
סגמנטציה מבוססת למידה עמוקה. לאימון מודל הפילוח להגדרת תמונת מיקרוסקופ חדשה, יש לנווט לתיקייה בשם train"ולהגדיר את הפרמטרים של גודל באך, מודל עמוד השדרה של הסגמנטציה, מספר התקופות וקצב הלמידה לאימון בתוך הקובץ בשם train_unet. py"הפעל את הקובץ train_unet.
py"כדי להתחיל את האימון. תהליך האימון מציג את המדד להערכת מודל הפילוח בערכת האימות המדומה. לאחר השלמת האימון, המודל נשמר best_model.
h5"בתיקייה בשם train"כדי לבדוק את המודל על תמונות המיקרוסקופ, יש לפצל את התמונות לגודל הרצוי על ידי מודל הרכבת. לשם כך, נווט אל התיקיה בשם 6. הכן נתוני בדיקה"והעתק את הקבצים בפורמט PNG של הנתונים לתיקייה PNG" והפעל את הקובץ split_1024_256.
py"פעולה זו תיצור חיתוך בגודל 256 על 256 של התמונות בתיקיית הנתונים. כדי לפלח את חיתוך התמונה, עבור אל התיקיה בשם 7. בדוק סגמנטציה"והפעל את הקובץ בשם מקטע.
py"לאחר הגדרת שם הדגם שנשמר לשימוש. התמונות המקוטעות נשמרות בתיקיית הפלט. ניתוח מורפולוגי.
מקם את הקובץ בשם make_montage. py"לתוך התיקייה בשם 7. בדוק סגמנטציה"והפעל את הקובץ כדי לתפור את הפלט המקוטע בחזרה לגודל המקורי של התמונה.
צור תיקיה חדשה בשם 9. ניתוח מורפולוגי"בתיקיית המקור ולנווט לתוכה. התקינו את ספריות הסקאן והים באמצעות הפקודה pip install seaborn skan"מסכות הפילוח עוברות שלד באמצעות ספרייה בשם skan"כדי לאפשר ניתוח הטופולוגיה של המיטוכונדריה הבודדת.
מקם את הקובץ בתיקיה 9. ניתוח מורפולוגי"סדרו את התמונות של קבוצות שונות של הניסוי לתיקיות שונות בתוך התיקייה 7. סגמנטציה של בדיקה"הפעל את הקובץ כדי ליצור עלילות לניתוח. תוצאות.
הניתוח הכמותי שיבוצע תלוי בשאלות המחקר או בהשערה. בניסוי שלנו, התעניינו בשלוש המורפולוגיות השונות של המיטוכונדריה, כלומר נקודות"סיביות מיטוכונדריה קטנות, מוטות דמויי סיבים או מחרוזת כמו מיטוכונדריה, ורשתות מרובות הסתעפויות"כדי לזהות את המורפולוגיה, אנו תחילה שלד את פלט הסגמנטציה ומנתח את קישורי הענפים של המעמדות השונים. אנו מראים את תוצאות הניתוח עבור שתי קבוצות התאים המותאמים לגלקטוזים, קבוצת הביקורת וקבוצת הטיפול ב-CCCP.
אנו רואים עלייה משמעותית באורך הענף הממוצע של נקודות, וזה צפוי, בהתחשב בנפיחות המיטוכונדריה לעבור כאשר נחשפים CCCP. אחוז המיטוכונדריה באורכים בודדים של מוטות ומחלקות רשת מופחת באופן משמעותי ביחס לבקרה כאשר התאים טופלו ב- CCCP, ובכך לאמת את ההשערה שלנו. תרחיש מאתגר לשיטה שלנו הוא כאשר התמונה עמוסה במיטוכונדריה צפופה.
הצבע הוורוד מציין את המיטוכונדריה היחידה הארוכה ביותר שזוהתה בתמונה, אשר נגרמת עקב השגיאה המוגברת בתוצאות הסגמנטציה. מקרי כשל אלה יכולים להיות מזוהים על ידי שליטה על אורכי המיטוכונדריה ושימוש באופרטורים מורפולוגיים. בעוד שהיישום שלנו הוא דוגמה לאופן שבו ביצענו ניתוח של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית, אנו מאמינים כי ניתוח כזה ושאלות מחקר סביבו יכולים להיות מנוסחים עבור היבטים שונים של mitophagy וניסויים ביולוגיים קשורים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה חדשנית המשתמשת בלמידת מכונה תחת פיקוח סימולציה כדי להפוך לאוטומטי את ניתוח המורפולוגיה של מיטוכונדריה בתמונות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים מקובעים. השיטה פותרת מגבלות של טכניקות סגמנטציה מסורתיות, כגון סימון ידני ושיטות של קביעת סף.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מחקר
- למידת מכונה
- מיקרוסקופיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- טכניקות קיימות לסגמנטציית מיטוכונדריה כוללות שיטות של סף (thresholding) ידניות ואוטומטיות.
- סגמנטציה ידנית היא תהליך גוזל זמן והיא נתונה לטעויות אנוש.
- סגמנטציה באמצעות למידה עמוקה דורשת מערכי נתונים גדולים של תמונות מוערות.
שיטות שנבחנו
- מתודולוגיית למידה מכונה תחת פיקוח סימולציה
- תאי קרדיומיובלאסט מקובעים כמערכת הביולוגית
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לדימות
תוצאות עיקריות
- השיטה המוצעת משפרת באופן משמעותי את דיוק הסגמנטציה ללא צורך במאגרי נתונים של קרקע-אמת (ground-truth) מתויגים.
- נבחנה השפעת הטיפול ב-CCCP על המורפולוגיה של המיטוכונדריה.
- נתוני אימון מדומים הותאמו לתנאי הניסוי לצורך תיקוף מדויק.
מסקנות
- מחקר זה מדגים את היעילות של למידת מכונה בפיקוח סימולציה לשיפור ניתוח מיטוכונדריאלי.
- לשיטה זו השלכות משמעותיות על אוטומציה של ניתוח מורפולוגי במחקר ביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמי שמי של מורפולוגיית המיטוכונדריה הוא קריטי עבור צוותי גילוי מוקדם השואפים לקשר בין פנוטיפים תת-תאיים למנגנוני מחלה ולהשערות טיפוליות. סגמנטציה באמצעות למידה עמוקה תחת פיקוח סימולציה מסירה צווארי בקבוק של התוויה ידנית, ומאפשרת כימות מורפולוגי הניתן להרחבה, לשחזור ובביטחון גבוה תחת תנאים ניסיוניים מגוונים. יכולת זו מחזקת את הביטחון החזוי בנקודות המפנה של תיקוף המטרה וסריקה פנוטיפית, ובכך תומכת בהחלטות תיק מותאמות סיכון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מעמיקה של פנוטיפים מיטוכונדריאליים תחת הפרעות שונות לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות שינויים מורפולוגיים הקשורים למודולציה של מסלולים.
- מקל על ניתוח מונחה-השערות ללא צורך בסגמנטציה ידנית עתירת עבודה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבצע אוטומציה של פלגום וכימות, ובכך תומך בפיתוח בדיקות סטנדרטיות לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
- מספק פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור ומתאימים להערכה השוואתית של תרכובות.
- מפחית הטיות של המפעיל ומגביר את הספיקולציה (throughput) עבור קמפיינים של סריקה הכוללים נקודות קצה של מורפולוגיה תת-תאית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר התאמה של פנוטיפים מיטוכונדריאליים in vitro עם מודלים תאיים הרלוונטיים למחלה.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מדדים מורפולוגיים סטנדרטיים.
- משפר את הערך החזוי לפיתוח ביומרקרים תרגומיים כאשר המורפולוגיה המיטוכונדריאלית מעורבת.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
תהליך סגמנטציה זה, המנוהל באמצעות סימולציה, משלב שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד לזיהוי המולקולה המובילה (lead identification), ובכך מספק יכולת אנליטית הניתנת לשימוש חוזר לצורך כימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לניתוח פנוטיפי כמותי.
- סריקה: מספקת תוצרי סגמנטציה שחזירים ומוכנים לבדיקה עבור זרימות עבודה של סריקות המשך.
- אנליטיקה: מספקת מדדים מורפולוגיים כמותיים ותוצרי סטטיסטיקה להשוואה רבדית של תנאים.
- מחקר תרגומי: מסייעת בהלימה בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים של מחלות כאשר מורפולוגיה מיטוכונדריאלית היא רלוונטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה כלי סגמנטציה הניתן להרחבה, ללא צורך באנוטציה, שניתן להתאימו למספר פרויקטים ומערכות תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי פנוטיפ מיטוכונדריאלי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ואוטומציה של סגמנטציה, לשיפור השחזוריות והיכולת להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת תהליך (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים מורפולוגיים כמותיים ואיכותיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות עם נקודות סיום מיטוכונדריאליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובהגדרת מודלים של למידת מכונה.
- נדרשת תשתית מחשוב עבור זרימות עבודה של סימולציה, אימון ואנליזה של תמונות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הדמיה ופורמטים של נתונים לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה לסוגי תאים שונים ותנאים ניסיוניים שונים באמצעות פרמטריזציה מתאימה של הסימולציה.
- הביצועים עלולים להיפגע במקרים של אอร์גנלות צפופות או מורפולוגיות שאינן טיפוסיות, דבר המצריך שלבי בקרת איכות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:11
Introduction
2:16
Cell Culture
2:47
Experimental Procedure
3:29
Staining and Mounting of Cells on Cover Slips
4:15
Microscopy and Imaging
4:51
Generating Simulated Training Data
7:02
Deep Learning Based Segmentation
8:58
Morphological Analysis
10:09
Results
11:42
Conclusion
