שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים
30 ביוני 2023
פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה להתפשטות, התמיינות וצביעה של תאי SH-SY5Y בתרבית ותאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה לצורך הדמיה וניתוח של מבנה אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).
תוכנית המחקר שלנו מתמקדת בהיבטים מבניים ותפקודיים של מיטוכונדריה, במיוחד כאשר הם קשורים לתפקוד לקוי הקשור להזדקנות. לשם כך, אנו משתמשים במגוון רחב של טכניקות ביופיזיקליות, ביוכימיות ומבניות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של הזדקנות מיטוכונדריאלית ולפתח התערבויות טיפוליות לשימור ושיקום בריאות המיטוכונדריה. תפקוד ומבנה המיטוכונדריה קשורים קשר בל יינתק.
טכניקות סטנדרטיות של מיקרוסקופ אור מתאימות למדידת תכונות מיטוכונדריאליות בקנה מידה גדול כמו מורפולוגיה בסיסית ומבני רשת. ניתוח מבנה אולטרה מיטוכונדריאלי או תכונות הדורשות רזולוציה גבוהה יותר מזו הניתנת על ידי מיקרוסקופ אופטי מסורתי נעשה בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים או טומוגרפיה על דגימות קבועות. מיקרוסקופ סופר רזולוציה הוא טכניקת הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות המודדת תכונות מעבר לגבול העקיפה.
עבור מיטוכונדריה, זה כולל מדידות של התפלגות חלבונים בקנה מידה ננומטרי וארכיטקטורת cristae. פרוטוקול ההדמיה המתואר כאן מאפשר לחוקרים למדוד את המבנה המפורט של הממברנה הפנימית בתאים חיים. הדמיה של תאים חיים מאפשרת לנו לצפות ולנתח כמותית תכונות מורכבות של cristae בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ללא צורך בקיבוע דגימה.
זה ייתן לחוקרים תובנות חדשות על השינויים הדינמיים המתרחשים בתכונות אולטרה מבניות והתגובות הטמפורליות שלהם לגורמי לחץ ותרכובות פרמקולוגיות.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להנבטה, דיפרנציאציה וצביעה של תאי SH-SY5Y ושל נוירונים ראשוניים מהיפוקמפוס של חולדה. המטרה היא להדמיות ולניתוח של אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופיית STED (stimulated emission depletion), במטרה לספק תובנות לגבי הדינמיקה המבנית של מיטוכונדריה בתאים חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר מיטוכונדריאלי
רקע
- מבנה המיטוכונדריה ותפקודה חיוניים לבריאות התא.
- מיקרוסקופיה מסורתית מוגבלת ברזולוציה שלה לצורך ניתוח אולטרה-מבני.
- מיקרוסקופיית רזולוציה-על (Super resolution microscopy) מאפשרת דימות מפורט יותר של מאפייני המיטוכונדריה.
- הבנת שינויים במיטוכונדריה יכולה לספק תובנות לגבי הזדקנות וליקויים תפקודיים.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה מהימנה לחקר האולטרסטרוקטורה המיטוכונדריאלית בתאים חיים.
- מתן אפשרות לחוקרים לנתח שינויים דינמיים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית.
- יצירת בסיס לחקירת תגובות מיטוכונדריאליות לטיפולים שונים.
שיטות שהשתמשו בהן
- תרבית תאים ודיפרנציאציה של תאי נוירובלסטומה מסוג SH-SY5Y.
- הכנת נוירונים ראשוניים מהיפוקמפוס של חולדה.
- שימוש במיקרוסקופיית STED לצילום ברזולוציה גבוהה.
- שלבים מרכזיים כוללים הפשרת תאים, ציפוי של לביבות זכוכית (cover slips) וצביעה ב-PKMO.
- רכישת תמונות וניתוח באמצעות תוכנה ותוספים ייעודיים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של מבנים מיטוכונדריאליים ברזולוציה ננומטרית.
- תובנות לגבי ארכיטקטורת הקריסטה (cristae) והפצת חלבונים בתוך המיטוכונדריה.
- ניתוח כמותי של שינויים במאפיינים מיטוכונדריאליים תחת תנאים פיזיולוגיים.
- ממצאים בעלי פוטנציאל משמעותי בנוגע לתגובת המיטוכונדריה לתרכובות פרמקולוגיות.
מסקנות
- המחקר מדגים טכניקה בעלת ערב לבדיקת דינמיקה מיטוכונדריאלית בתאים חיים.
- תורם להבנת תפקיד המיטוכונדריה בהזדקנות תאית ובבריאות.
- השלכות על התערבויות טיפוליות שמטרתן לשחזר את התפקוד המיטוכונדריאלי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי STED של תאים חיים של אולטרה-מבנה ממברנת המיטוכונדריה הפנימית במודלים עצביים מאפשר ויזואליזציה ישירה וכמותית של ארכיטקטורת ה-cristae והתפלגויות חלבונים ברמה הננומטרית תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית. יכולת זו נותנת מענה לפער קריטי בקישור בין מבנה המיטוכונדריה לתפקוד ולמנגנוני מחלה, ובכך תומכת בביטחון חיזוי במחקרים על ניוון עצבי מוקדם ובתיקוף מטרות. שילוב של דימוי ברזולוציה-על (super-resolution) בתהליכי גילוי משפר את הפחתת הסיכונים המכניסטית ומסייע בקבלת החלטות מותאמות סיכונים לגבי תיקי פיתוח של תוכניות לטיפולים נוירותרפויטיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של היפותזות לגבי המבנה המיטוכונדריאלי במערכות נוירונליות חיות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות של מורפולוגיית הקריסטה והדינמיקה שלה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור תפקוד לקוי של מיטוכונדריה במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות.
- מספק ראיות ברזולוציה גבוהה לביסוס ביטחון חיזוי ותיעדוף של מטרות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס בדיקות דימוי של תאים חיים שעברו תיקוף לצורך כימות של מבנה על-מיקרוסקופי מיטוכונדריאלי.
- מספק תוצאים כמותיים הניתנים לשחזור עבור מדידות של מחזוריות, גודל וצורת ה-cristae.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה והכנת הפלטפורמה לסריקת תרכובות המשפיעות על המורפולוגיה המיטוכונדריאלית.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות פרמקולוגיות על מאפייני הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה בין מדדים מבניים של מיטוכונדריה לבין מודלים עצביים הרלוונטיים למחלה.
- מספק רצף משלב הדימוג של שלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות המכוונות למיטוכונדריה.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי קידום מבוססות התאמה לסיכון, על בסיס נתונים אולטרה-מבניים כמותיים ודינמיים.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים לבריאות מיטוכונדריאלית בניוורו-דגנרציה.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
פרוטוקול דימות STED של תאים חיים זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקרe ትרגומי במודלים של מחלות נוירונליות.
- ביולוגיה של גילוי: דימות כמותי של ארכיטקטורת הקריסטה תומך בבדיקת השערות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים במחקר מיטוכונדריאלי.
- סריקה: תוצרים ברזולוציה גבוהה וניתנים לשחזור מאפשרים מוכנות של הבדיקה להערכת תרכובות המכוונות למבנה המיטוכונדריה.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של מחזוריות, גודל וצורה של הקריסטה להשוואה אמינה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מסייע בהתאמה של שינויים אולטרה-מבניים במיטוכונדריה עם פנוטיפים רלוונטיים למחלה במודלים עצביים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה של דימות וניתוח שניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה במערכות תאים עצביים ומערכות תאים אחרות למחקרים מיטוכונדריאליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות מיטוכונדריאליות.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה של דימוי סטנדרטיים, הניתנים לשחזור ולהרחבה, לצורך ניתוח אולטרה-מבנה של תאים חיים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go ומשפר את היעילות ההונית על ידי אספקת נתונים כמותיים בעלי תוכן גבוה בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות למחלות ניוורו-דגנרטיביות המכוונות לבריאות המיטוכונדריה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיית רזולוציית-על (super-resolution) של תאים חיים ובניתוח תמונות.
- נדרשת גישה למכשור STED מתקדם ולתוכנה תואמת לעיבוד תמונות.
- נדרש סטנדרטיזציה של פרמטרי הדמיה ופרוטוקולי סגמנטציה בין צוותים שונים.
- התאמה למודלים עצביים ולא-עצביים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות טכניות כוללות את הצורך בכיול מדויק ואפשרות לפוטוטוקסיות בהדמיה של תאים חיים.
