יצירת פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזואיטים

כיום יש לנו הבנה מוגבלת של הביולוגיה של זיהום פלסמודיום של הכבד. פרוטוקול זה עזר לנו ליצור הרבה קווים טרנסגניים שעזרו לענות על כמה שאלות קריטיות על הביולוגיה של האורגניזם. הבנה בסיסית של הטפיל והביולוגיה שלו נדרשת כדי לפתח כלים וגישות חדשות למאבק בזיהום המלריה.

שיטת הטרנסגנזה שאנו מתארים כאן סייעה לנו לפענח כמה ביולוגיות מפתח ומורכבות של האורגניזם, כמו גם של הפונדקאי. מי שידגים את ההליך הזה יהיה קרסון באוורס, מנהל המעבדה שלי. לאחר יצירת עכברים נגועים ב- P.Bergehei והרדמתם, אספו שני מיליליטר דם משני עכברים נגועים לחמישה מיליליטר של תמיסת Elsevier בסביבה סטרילית.

צנטריפוגה את הדם ב 450 גרם במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-10 מיליליטר של מדיית סל"ד מלאה. צנטריפוץ את מתלה התא שוב להשעות מחדש את הגלולה ב 25 מיליליטר של מדיה RPMI מלאה.

העבירו את מתלה התאים לבקבוק תרבית T75 עם מכסה מסנן ודגרו עם רעידות עדינות כדי לשמור על התאים בהשעיה. בסוף הדגירה, לאסוף 500 מיקרוליטר של המדגם. צנטריפוגה ולהשעות מחדש את הגלולה ב 10 מיקרוליטר של מדיה RPMI מלאה.

לאחר מכן, להכין כתם דם דק. מכתימים את כתם הדם בכתם Giemsa וקובעים את תדירות הסכיזונטים. לקבלת יעילות transfection אופטימלית, 60 עד 70% של טפילים צריך להיות בשלב סכיזונט.

הכינו חיץ צנטריפוגה הדרגתי על ידי הרכבה מחדש של 13 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. מעבירים 25 מיליליטר של תרבית דם לצינור צנטריפוגה טרי של 50 מיליליטר. לאחר מכן שכבה בזהירות של 20 מיליליטר של חיץ צנטריפוגה הדרגתית לתחתית צינור הצנטריפוגה, באמצעות פיפטה זכוכית צרה כדי ליצור עמוד שיפוע ולהבטיח חלוקה ברורה בין החיץ לבין התקשורת.

צנטריפוגה את החיץ והמדיה המוכנים למשך 20 דקות ב 450 G ללא הפסקה בטמפרטורת החדר. בעזרת פיפטה למרעה, מסירים בזהירות את שכבת הסכיזונט בממשק של אמצעי התרבות ומאגר הצנטריפוגות ההדרגתי. הניחו אותו בצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר.

השהה מחדש את הסכיזונטים המבודדים במדיית RPMI מלאה והגדל את הנפח הכולל ל -40 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה והשלכת הסופר-נטנט, השהה מחדש את הסכיזונט ב-10 מיליליטר של מדיית סל"ד מלאה. לאחר מכן להעביר מיליליטר אחד של פתרון זה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עבור כל transfection ו pellet את התאים נגועים על ידי צנטריפוגה ב 16, 000 G במשך חמש שניות.

לאחר מכן, שלב 100 מיקרוליטר של חיץ אלקטרופורציה בטמפרטורת החדר עם חמישה מיקרוגרם של DNA פלסמיד המטרה בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה של התאים הנגועים, להסיר את supernatant בזהירות להשעות מחדש את התאים בתמיסת נוקלאופקטור מוכן בתוספת DNA פלסמיד. לאחר מכן להעביר את התרחיף לתוך electroporation, cuvettes, ו transfect באמצעות תוכנית נוקלאופקטור מתאים.

לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של מדיה RPMI מלא לקובט. מעבירים את התמיסה כולה לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ומניחים אותה על קרח. יש לוודא את רמות הטפילים בעכברים שחוסנו בסכיזונט הנגוע מדי יום מיומיים לאחר החיסון.

לאחר אישור הזיהום, התחל בבחירת התרופה על ידי מתן התרופה דרך הפה ומי השתייה המוצעים אד ליביטום. לפקח על פרזיטמיה באמצעות מריחות דם החל משישה ימים לאחר תחילת הטיפול pyromethymine. כאשר הטפילים מגיעים ל-1% לפחות, העבירו את הטפילים לעכברי B6 תמימים כדי ליצור מלאי טפילים בשלב הדם.

ברגע שהפרזיטמיה מגיעה ל-2%-5%, לייצר מניות ולשמר אותן בהקפאה. יום לפני הדבקת היתושים, הפרידו בין נקבות היתושים על ידי הנחת כפפה מלאה במים שחוממו ל-37 מעלות צלזיוס על גבי הכלוב המכיל יתושים זכרים ונקבות כאחד. השתמשו בשואב חרקים כדי לסלק את נקבות היתושים הנמשכות למקור החום ולהעבירן לכלוב קטן יותר להדבקה.

ביום האכלת יתושים והדבקה, לקבוע טפיל בעכברי B6 נגועים. פרזיטמיה בין 2% ל-5% היא אופטימלית להדבקת יתושים. לאחר אימות הטפיל, העבירו את הזיהום לנקבות היתושים על ידי הנחת העכברים המורדמים על נקבות היתושים הכלואות תחת שכיבה עצם החזה.

פזרו ידנית את הרגליים הקדמיות והאחוריות כדי לספק את שטח הפנים הגדול ביותר להאכלת יתושים. השאירו את העכברים הנגועים בכל כלוב למשך 15 דקות, בדקו כל חמש דקות כדי לוודא שהעכברים אינם ערים. לאחר סיום ההאכלה והעכברים מורדמים, יש להיפטר מהם בבטחה בהתאם להנחיות המוסד.

כדי לוודא הדבקה מוצלחת בתוך היתושים, בודדו את היתושים באמצע המעי על ידי הסרת מקטע הבטן הסופי עם מלקחיים 10 ימים לאחר ההדבקה. לאחר מכן צפו במעי התיכון תחת אור מקוטב כדי לזהות נוכחות של ביציות. לאחר 18 ימים לאחר ההדבקה, לנתח חמישה עד 10 יתושים כדי להעריך את מספר sporozoites הנוכחים.

כדי לבודד ולספור את sporozoites, בזהירות להסיר את ראש היתוש תוך הפעלת לחץ על בית החזה עם מלקחיים או מחט לנתח בסדר. בלוטות הרוק יישארו מחוברות לראש שהוסר. לאחר מכן, הסירו פסולת יתושים נוספת מבלוטות הרוק והניחו אותם בצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל 400 מיקרוליטר של אמצעי דיסקציה של יתושים.

לאחר מכן לשבש את בלוטות הרוק המבודדות על ידי העברתן דרך מזרק מחט 30 מד 15 עד 20 פעמים, לאחר מכן, מניחים 10 מיקרוליטר של בלוטות הרוק המשובשות במדיה דיסקציה יתושים לתוך hemocytometer ולספור. לבסוף, יש להשהות מחדש את בלוטות הרוק בריכוז הרצוי של אמצעי דיסקציה של יתושים או PBS לצורך הזרקה לעכברים או שימור בהקפאה לטווח ארוך. בדומה לתמונות מיקרוסקופיות המתארות P.berghei schizont בוגר ולא בוגר בתרביות דם של עכברים טפיליים.

כמו תמונות מיקרוסקופיות של ראש יתוש עם בלוטות הרוק עדיין שלמות במהלך הדיסקציה, ובלוטת הרוק המנותחת תחת הגדלות נמוכות וגבוהות יותר מוצגות. הדור של אות פלואורסצנטי ירוק ב- PB, GFP 11 נגוע HEPA GFP אחד עד 10 תאים מארחים הצביע על ליזה של vacuole parasitophorous. חשוב להסיר בזהירות את שכבת השייסון מבלי להפריע לממשק ההדרגתי.

כמו כן, זה לוקח קצת תרגול כדי להסיר באופן אמין את בלוטות הרוק יחד עם הראש במהלך בידוד אור נבגים. לאחר הבידוד, ספורוזואיטים טרנסגניים יכולים להישמר בהקפאה או להשתמש בהם טריים למחקרי זיהום in vivo או in vitro.