רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות
16 בינואר 2024
עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.
הקבוצה שלנו מתעניינת במעגלים העצביים ובמנגנונים הסינפטיים שבבסיס עיבוד הראייה ברשתית. מעבדת מורגן חוקרת מנגנונים מולקולריים של הסתגלות לאור בתאים דו-קוטביים, ומעבדת סיוויר מתעניינת באופן שבו נוירונים ברשתית הפנימית תורמים לתפקוד תאי הגנגליון. גישה לנוירונים בשכבה הבין-גרעינית ברשתית הר שלמה היא אתגר למחקרים אנטומיים ופיזיולוגיים כאחד.
נוירונים בשכבה הבין-גרעינית נגישים במקטעים אנכיים, אבל הם מעט מאוד נוירונים בשדה הראייה. יתר על כן, חיתוך מנתק תהליכים וקשרים רוחביים שיכולים להשפיע על מחקרים פיזיולוגיים. הסרת הפוטורצפטורים בטכניקת הרשתית המפוצלת משפרת באופן דרמטי את דיפוזיית הנוגדנים לתוך הרשתית הפנימית, מה שהופך את התיוג החיסוני של מטרות הרשתית הפנימית למהיר פי 20 בהשוואה לרשתית שלמה מסורתית.
הרשתית המפוצלת גם משפרת מאוד את הגישה לנוירונים בשכבה הבין-גרעינית במהלך אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי. טכניקת הרשתית המפוצלת תפתח דלתות לגישות חדשות ותאיץ את קצב הניסויים שלנו. לדוגמה, אנו מתכננים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור קלט תאים דו-קוטביים לתאי גנגליון מלנופסין על ידי ביטוי צ'אנלרודופסין בתאים הדו-קוטביים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשה להכנת רשתית בפריסה שטוחה (flatmount), המשפרת את דיפוזיית הנוגדנים ומאפשרת גישה טובה יותר לנוירונים של השכבות הפנימיות של הרשתית. הטכניקה משפרת באופן משמעותי את היעילות של ניסויי אימונוהיסטוכימיה, היברידיזציה in situ ואלקטרופיזיולוגיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הרשתית
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- מעבדת Morgans חוקרת מנגנוני הסתגלות לאור בתאי בולאר (bipolar cells).
- מעבדת Sivyer מתמקדת בנוירונים של הרשתית הפנימית ובתפקידם בתפקוד תאי הגנגליון.
- טכניקות מסורתיות של הרכבה שלמה (whole mount) מציבות אתגרים בחקר נוירונים של השכבה הגרעינית הפנימית.
- הסרת פוטורצפטורים מאפשרת גישה טובה יותר ומקצרת את זמן הסימון בנוגדנים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה המאפשרת גישה מהירה יותר לנוירונים של הרשתית הפנימית.
- שיפור היעילות של סימון אימונוהיסטוכימי וניסויי אלקטרופיזיולוגיה.
- בדיקה מעמיקה יותר של קלטי תאי דו-קוטביים לתאי גנגליון המכילים melanopsin.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש בטכניקת דיסקציה של הרשתית ex vivo להכנת רשתית במבנה שטוח (flatmount).
- המודל הביולוגי כלל דיסקציה של הרשתית מעיני עכבר, מה שאיפשר גישה לנוירונים בשכבה הגרעינית הפנימית.
- לצורך הניתוח נעשה שימוש בטכניקות של אימונופלואורסצנציה ואלקטרופיזיולוגיה.
- השלבים הקריטיים כללו דיסקציה זהירה, שטיפה ב-PBS והעברה למדיום Ames המועשר בקרבוגן.
- דיפוזיית הנוגדנים נבחנה לאחר דגירה של שעה אחת.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה החדשה הובילה לדיפוזיה של נוגדנים שהייתה מהירה פי 20 משיטות קונבנציונליות.
- שלמות הסינפסות של הפוטורספטורים נשמרה במהלך תהליך ההכנה.
- נצפתה שונות אזורית בחיוניות התאים לאחר הפיצול, כאשר מרבית תאי הרשתית נותרו חיוניים.
- תוצאות אימונופלואורסצנציה אישרו את שימורם של הסיומות הסינפטיות של הפוטורספטורים.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת גישה קלה יותר לנוירונים של הרשתית הפנימית עבור גישות ניסוייות שונות.
- היא משפרת את המהירות והיעילות של סימון אימונוהיסטוכימי ומחקרים פיזיולוגיים.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על חקירות נוספות של מנגנונים נוירונליים ברשתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישה יעילה לנוירונים בשכבה הגרעינית הפנימית (inner nuclear layer) היא קריטית להפחתת סיכונים במטרות בשלבים מוקדמים של תחום האופתלמולוגיה ולאימות השערות מכניסטיות בגילוי תרופות לרשתית. הכנת דגימה של רשתית מפוצלת במבנה שטוח (split retina flatmount) מאיצה תיוג אימונולוגי כמותי ובדיקה אלקטרופיזיולוגית, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בניתוח מסלולים נוירונליים. יכולת זו משפרת את תהליך המיון של תיקי הפיתוח ומספקת בסיס להמשכיות תרגומית עבור תוכניות מחקר בתחום הראייה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של מעגלי התאים הבי-פולריים וההוריזונטליים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שימור קשרים נוירונליים לטראליים.
- מקל על בדיקה מהירה של היפותזות בנוגע למנגנונים סינפטיים הרלוונטיים לעיבוד חזותי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מספק מערכת ביולוגית מתוקפת לבדיקות patch-clamp וסימון אימונולוגי (immunolabeling) בתפוקה גבוהה.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה על ידי שמירה על שלמות הסינפסה ועל חיוניות התאים.
- מספק תוצאות כמותיות לסריקת השפעות של תרכובות על נוירונים של הרשתית הפנימית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מותאם למודלים רלוונטיים למחלות לצורך חקר מעגלים רטינליים המעורבים בהפרעות ראייה.
- מאפשר המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה במספר מודליות אנליטיות.
- מפחית את הסיכון לממצאים ארטיפקטואליים על ידי שימור הקישוריות הפיזיולוגית במודל הרקמה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הכנה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוחים תפקודיים ומולקולריים חסונים של נוירונים ברשתית הפנימית.
- ביולוגיה של התגליות: מאיצה את בדיקת ההשערות לגבי מסלולים עצביים ומנגנונים סינפטיים.
- סריקה: תומכת בקבלת תוצאות אלקטרופיזיולוגיות ובסימון אימונולוגי מהיר וניתן לשחזור.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של דיפוזיה של נוגדנים וחיוניות תאים למחקרים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: שומרת על מעגלים רלוונטיים למחלה עבור מחקרי סמנים ביולוגיים ומנגנונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה רב-שימושית עבור יישומים מגוונים של סריקה ומחקר רשתית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות ברשתית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של ההכנה עבור תהליכי עבודה ניתנים לשחזור ובנייד (scalable) בין צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר בנושאי המשך או הפסקה (go/no-go) וקידום יעיל של נכסי מחקר בתחום הראייה תוך ניצול אופטימלי של ההון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של מטרות ושיטות טיפול (modalities) ברשתית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של הרשתית וטיפול ברקמות לקבלת תוצאות אופטימליות.
- נדרשת גישה לציוד של אלקטרופיזיולוגיה ואימונופלורסצנציה.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת הדירות במחקרים רב-מרכזיים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מינים שונים או מודלים של מחלה.
- יש לנטר שונות אזורית בחיוניות התאים במהלך היישום.
