כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין פרוסות רקמה דקות מרשתית סלמנדרת נמר מימית, ולהשתמש בהן להקלטות מהדק מתח תא שלם בו זמנית מקולטני אור ותאים אופקיים ודו קוטביים מסדר שני. זה מושג על ידי ניתוח עין סלמנדרה ובידוד הרשתית על פיסת קרום ניטרוצלולוזה. השלב השני הוא לחתוך פרוסות רשתית דקות ולמקם אותן בתא ההקלטה.

לאחר מכן, החדר ממוקם על במה קבועה זקופה מיקרוסקופ ופיפטות תיקון ממוקמות מעל פרוסות הרשתית. השלב האחרון הוא להשיג הקלטות תאים שלמים מתא פרה-סינפטי, קולטן אור ותא אופקי או דו קוטבי פוסט-סינפטי. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהקלטות תאים שלמים מזווגות כדי לתמרן את השחרור הסינפטי ולחקור את האינטראקציות בין תאים ברשתית.

תכשיר פרוסות הרשתית פותח במקור במעבדותיהם של פרנק ורבלין וסם וו.בניגוד לתכשירים חד-תאיים, תכשירי פרוסות שמרו על מגע פנימי שלם, ובניגוד לתכשירי רשתית שלמה, חיתוך הרשתית חושף שכבות רשתית שונות, ומאפשר גישה נוחה לכל סוגי התאים השונים. בפרוסת הרשתית. ניתן להשתמש בתכשירים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות, כולל הקלטה סימולטנית למספר תאים ולניסויי הדמיה.

תכשיר זה הוכיח את עצמו כבעל ערך רב לחקר אינטראקציות סינפטיות בין נוירונים ברשתית. בסרטון זה אנו מתארים הכנת פרוסות באמצעות רשתית סלמנדרה נמר, ומדגישים כמה מהפרטים הקטנים שיכולים לעשות את ההבדל בין הצלחה לכישלון. התחל הליך זה על ידי הרכבת החדר.

הנח שני חרוזים של שומן ואקום במרווחים של שמונה עד 10 מילימטרים זה מזה על פני תא ההקלטה כדי ליצור תעלה לסופר פאזה ולהטמיע את פרוסות הרטינול בפעימה שנייה של שומן, כמה מילימטרים מעבר לכל אחד משני חרוזי השומן הללו כדי לשמש כהיטל להגבלת הזליגה. לאחר מכן הנח חתיכה משולשת קטנה של מגבון קים בקצה החדר כדי להבטיח מגע נוזלים עם אלקטרודת הייחוס. לאחר מכן, לחץ על חתיכת קרום ניטרוצלולוזה שטוחה כנגד מיקרוסקופ הזכוכית.

החלק על שני חרוזים קטנים של שומן ואקום. להכנת פורס הרקמות. שוברים סכין גילוח פיפיות לארבעה חלקים.

ואז חבר אחד מהם לזרוע החיתוך. ודא שקצה החיתוך של סכין הגילוח מונח שטוח על תא ההקלטה על ידי חיתוך פרוסה דקה של נייר סינון ניטרוצלולוזה. לאחר מכן, לאחר המתת חסד של סלמנדרה על ידי עריפת ראש, גרעין את העין באמצעות מספריים ונציה קטנה מתחת למיקרוסקופ, חתך את העור המחבר את העין למסלול שמסביב.

לאחר מכן משוך את העין קדימה והחלק את המספריים מתחתיה כדי לחתוך את שרירי העיניים ועצב הראייה. לאחר מכן, הניחו את העין הגרעינית על מצע כותנה על גוש לינוליאום. כעת בצע חתך קטן במרכז הקרנית בעזרת להב כירורגי חד.

הסר את הקרנית על ידי החלקת המספריים העדינים של ונציה לתוך החתך והארכת החתך באופן רדיאלי החוצה לכיוון ההילה Serrata. לאחר מכן חותכים בצורה היקפית סביב ההילה serrata על ידי סיבוב גוש הלינוליאום או הכותנה בין החתכים. לאחר חיתוך כל הדרך סביב העין, הסר את הקרנית והעדשה על ידי משיכתן מהצד של העין.

העבירו את גביעונית העיניים הנותרת על משטח קשיח של גוש הלינוליאום שהורטב בתמיסת מלח דו-חיים. חותכים אותו לשליש בעזרת סכין גילוח חד בתנועת ניסור עדינה כדי להבטיח שהוא חותך את כל הדרך דרך הסקלרה. לאחר מכן הנח חתיכה אחת או שתיים של IUP על קרום הניטרוצלולוזה כשמשטח הרשתית פונה כלפי מטה.

טבלו את החלקים הנותרים במי מלח נוספים. לאחר מכן, הכניסו אותם למקרר למקרה שייחתכו פרוסות נוספות מאוחר יותר. כעת, לחץ בעדינות את חתיכת ה-IUP על קרום הניטרוצלולוזה בעזרת זוג מלקחיים עדינים.

טבלו את קרום הניטרוצלולוזה ואת חתיכת ה-IUP בכמה טיפות של מי מלח דו-חיים קרים. לאחר מכן מסננים את תמיסת המלח על ידי נגיעה בחתיכת מגבון קים בשולי קרום הניטרוצלולוזה ו-iup. לאחר מכן, טבלו את ה-IUP בקרום ניטרוצלולוזה עם כמה טיפות של תמיסת מלח דו-חיים קרה.

שוב, לאחר מכן מקלפים את אפיתל פיגמנט הרשתית של סקלרה כורואיד כדי לבודד את הרשתית. אם הרשתית לא נדבקה בחוזקה, מסננים את מי המלח בעזרת מגבון קים. על מנת למשוך את הרשתית בצורה חזקה יותר אל קרום הניטרוצלולוזה, החלף את מי המלח וחזור על ההליך במידת הצורך.

לאחר מכן, מלאו את החדר במי מלח דו-חיים קרים. העבר אותו לשלב פורס הרקמות. לאחר מכן פורסים את הרשתית ואת קרום הניטרוצלולוזה לרצועות דקות של 125 מיקרון על ידי לחיצה על סכין הגילוח בעדינות אך בחוזקה דרכן.

לאחר חיתוך הרשתית כולה לפרוסות, העבירו את פרוסות הרשתית בזו אחר זו לערוץ הראשי של תא ההקלטה. כדי להעביר פרוסה, החזק רצועת קרום במקומה תוך החלקת החדר מתחתיה. הקפד לשמור על הפרוסה שקועה כשהיא מעל החלק המרכזי של החדר.

הטמיעו את שולי קרום הניטרוצלולוזה ברצועות שומן הוואקום וסובבו אותו 90 מעלות. כדי להציג את שכבות הרשתית, לחץ את קרום הניטרוצלולוזה שטוח על משטח הזכוכית, גם אם אין רשתית על כל חתיכה. הנח רצועות של קרום ניטרוצלולוזה במרווחים קבועים של כמילימטר כדי לסייע בפירוק מתח הפנים ובכך לשפר את זרימת הנוזלים.

המשיכו להעביר את הפרוסות בזו אחר זו עד שהפרוסות הונחו לכל אורך תעלת הזילוף. לאחר העברת כל הפרוסות, העבר את תא ההקלטה לשלב של מיקרוסקופ שלב קבוע זקוף. חבר את כבל אלקטרודת הייחוס לחוט הארקה בראש המגברtage.

התמקדו בפרוסות באמצעות טבילה במים למרחק עבודה ארוך פי 40 עד 60 מטרה. הסופר הבא. ממזגים את הפרוסות בקצב של מילימטר לדקה עם תמיסת מלח דו-חיים מבעבעת בחמצן.

חבר את קו היניקה לקו הפלט של החדר. לאחר מכן כוונן את הזרימה כדי לאזן את הזרימה על ידי סיבוב הקצה המשופע של מחט היניקה או על ידי הזזת מגבון הקים בקצה החדר קרוב יותר או רחוק יותר מהפתח בקצה מחט הזרימה. בדוק את הפרוסות באור עמום או אינפרא אדום.

לאחר מכן, זהה זוג תאים, קולטן אור ותא אופקי או דו קוטבי סמוך לסיטונאות. הקלטת פיליפ פיפטה שהוכנה לפני הניסויים בתמיסה התוך-תאית, הרכיב אותה על מחזיק האלקטרודה. לאחר מכן, הרם מעט את מטרת המיקרוסקופ.

מקם את פיפטת קולטני האור מתחת למטרה. לאחר מכן הורד אותו כך שהקצה ימוקם ממש מעל הפרוסה והתאם את המיקוד בו זמנית. כדי להימנע מללכת רחוק מדי.

חזור על הליך זה עם הפיפטה השנייה. לאחר מכן, בדוק את התנגדות הפיפטה עם דופק דה-פולריזציה של 5 עד 10 מילי-וולט. התאימו הסטה כלשהי ברמת זרם קו הבסיס במגבר.

לאחר מכן, הפעל לחץ חיובי קל, ובינתיים, מקם את הפיפטה הפוסט-סינפטית כך שתיצור קשר עם גוף התא האופקי או הדו-קוטבי. לאחר מכן מקם את הפיפטה הפרה-סינפטית כך שתיצור קשר עם גוף התא של מוט או קולטן אור חרוט. תוך כדי ניטור שחרור ההתנגדות, הלחץ החיובי על הפיפטה הפוסט-סינפטית, לפעמים שחרור הלחץ החיובי מספיק כדי ליצור חותם ג'יגה אוהם.

לאחר שהתנגדות הקצה גדלה ליותר מ-100 מגה אוהם, הפעל פוטנציאל החזקה של מינוס 60 מילי-וולט. לאחר מכן, כאשר מתקבל חותם ג'יגה אום, בטל את קיבול הפיפטה החולף. באמצעות מעגלי פיצוי הקיבול של מגבר מהדק התיקון, חזור על הליך התקרה עם פיפטת קולטני האור, תוך הפעלת פוטנציאל החזקה של מינוס 70 מילי-וולט ובטל את קיבול הפיפטה.

חולף, ואז קרע את המדבקה על ידי הפעלת יניקה על כל תא. קרע של המדבקה ניכר על ידי הופעת קיבול תא שלם חולף. כעת, אשר את זהות התא הפוסט-סינפטי מבחינה פיזיולוגית על ידי הפעלת הבזק אור והעברת סדרה של צעדי מתח ממינוס 120 לפלוס 40 מילי-וולט במרווחים של 20 מילי-וולט.

כדי להעריך אם התאים מחוברים סינפטית, ספק 60 מילי-וולט של 25 עד 100 אלפיות השנייה. צעד דה-פולריזציה לקולטן האור וחפש זרמים פוסט-סינפטיים. בתא העצב מסדר שני, הנה העקבות המייצגים של תגובות אור מהנוירונים בפרוסות אנכיות של רשתית הסלמנדרה.

התא האופקי החרוט והתא הדו-קוטבי החיצוני מציגים כולם זרם חיצוני בתגובה להופעת האור. הזרם הפנימי הבולט בעקבות הבזק האור בהקלטות התאים האופקיים והדו-קוטביים כאן נגרם על ידי שחרור מוגבר של גלוטמט מקולטני האור כשהם מתפרקים בהיסט האור. התא הדו-קוטבי מגיב בזרם פנימה בתחילת האור, הנובע מסימן ההופך מפל איתות של קולטן גלוטמט מטבוטרופי והפעלת ערוצי טריפם אחד.

ניתן להבחין בין תאים אופקיים ותאים דו קוטביים זה מזה על ידי יחסי המתח הנוכחיים שלהם. לתאים אופקיים יש בדרך כלל יחסי מתח זרם ליניאריים או מיישרים פנימה עם התנגדות כניסה של פחות מ-500 מגה-אוהם, לתאים דו-קוטביים יש יחס מתח זרם מיישר כלפי חוץ והתנגדות כניסה גבוהה יותר בין 0.5 לשני ג'יגה אוהם. איור זה מציג את התוצאות המייצגות מההקלטות של זוג תאים אופקיים חרוט וזוג תאים דו קוטביים של חרוט.

בכל מקרה, דה-פולריזציה של החרוט למינוס 10 מילי-וולט מפוטנציאל החזקה של מינוס 70 מילי-וולט עוררה זרם סידן מגודר מתח בחרוט ופוסט-סינפטי מהיר פנימה. זרם בתא האופקי או הדו-קוטבי פרוסת הרשתית. תכשירים שימשו במאות מחקרים על האנטומיה והפיזיולוגיה של הרשתית.

הם מועילים במיוחד לבחינת תגובות של תאים מרובים בו זמנית מכיוון שהם מאפשרים הקלטה והדמיה ממספר תאים בו זמנית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את הרשתית, לחתוך פרוסות רשתית דקות, למקם אותן בתא ההקלטה ולהשיג הקלטות סיטונאיות מזוגות של עצמיים המחוברים סינפטית.