מדריך לניתוח חישובי עבור Chimeric Small Noncoding RNA: Target RNA Sequencing Libraries
1 בדצמבר 2023
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המדגים התקנה ושימוש בצנרת ביואינפורמטיקה לניתוח נתוני ריצוף RNA כימריים המשמשים במחקר אינטראקציות in vivo RNA:RNA.
פרוטוקול זה מכסה את ההתקנה ואת השלבים המעשיים לשימוש בצנרת חישובית שנועדה לנתח נתוני ריצוף בתפוקה גבוהה מאינטראקציות כימריות שאינן מקודדות RNA-target RNA. האסטרטגיה המולקולרית ליצירת רנ"א כימרי היא פיתוח חדש יחסית שיש לו יתרונות בהשוואה לכלי חיזוי ביוכרומטיים קודמים בהבנה חד-משמעית של נוף האינטראקציה בין רנ"א ליעד RNA שאינו מקודד בגנום. נתוני ריצוף המופקים מריצוף התפוקה הגבוהה של הרנ"א הכימרי יכולים להוות אתגר ניתוח למאמצים חדשים של אסטרטגיה זו.
הקמנו צינור חישובי חוצה פלטפורמות בקוד פתוח עם הערות רבות כדי לאפשר למשתמשים ברמת הכניסה לנתח נתונים מניסויי ריצוף הרנ"א הכימריים שלהם שאינם מקודדים. בניסויים עתידיים, מעבדת Mefford מתכננת להשתמש בניתוח חישובי על ידי גרוטאות על מערך נתונים שנוצר מהחקירות המתמשכות שלנו על ויסות לאחר שעתוק במערכת העצבים של יונקים, כמו גם לשמור על גרוטאת עדכון ב- GitHub שלנו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להתקנה ולשימוש מעשי בצינור עיבוד (pipeline) של ביואינפורמטיקה בקוד פתוח, שנועד לנתח נתוני ריצוף של RNA כימרי, ובכך לסייע בהבנה טובה יותר של אינטראקציות RNA:RNA in vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביואינפורמטיקה
- ריצוף RNA
- אינטראקציות של RNA לא מקודד
רקע
- RNA כימרי מספק גישה חדשנית לחקר אינטראקציות של RNA.
- כלי ריצוף בתפוקה גבוהה חיוניים לניתוח נתוני RNA מורכבים.
- כלי חיזוי קודמים היו חסרי בהירות בהבנת נופי האינטראקציה של RNA.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- התקנה ושימוש בצינור החישוב (pipeline) של SCRAP.
- ניתוח של אינטראקציות בין RNA לא מקודד כימרי לבין RNA מטרה.
- שימוש ב-Conda וב-Git להגדרת הסביבה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מנחה את המשתמשים ביעילות בתהליך החישוב והניתוח.
- SCRAP זיהה ירידות משמעותיות באינטראקציות של miRNA עם אזורי אינטרונים.
- אינטראקציות RNA ברמת ביטחון גבוהה בודדו באמצעות Peak_Calling.
מסקנות
- המחקר מדגים שיטה יעילה לניתוח אינטראקציות של RNA כימרי.
- הוא רלוונטי לקידום הביואינפורמטיקה במחקר ביולוגיה של RNA.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מיפוי רחב-גנומי של אינטראקציות בין RNA קצר לא מקודד (sncRNA) לבין RNA מטרה הוא קריטי להפחתת סיכונים בתהליך התיקוף של המטרה ולהבהרת מנגנוני בקרה בשלבים מוקדמים של הגילוי. צינור העיבוד החישובִי SCRAP מאפשר לצוותי ביו-פארמה להפיק נתוני אינטראקציה כמותיים ובעלי ערך יישומי מספריות ריצוף של RNA כימרי, ובכך להפחית את העמימות בהשוואה לגישות המבוססות על חיזוי בלבד. יכולת זו תומכת בביטחון בחיזוי ומסייעת בתעדוף הפורטפוליו בנקודות הכרעה מרכזיות בגילוי תרופיתיות המכוונות ל-RNA.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של אינטראקציות בין sncRNA ל-RNA מטרה in vivo לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות אספקת ראיות לאון-אמביוואלנטיות לאינטראקציות ברמה הגנומית.
- מסייע בתיעדוף של מטרות RNA רגולטוריות בהתבסס על פרופילים כמותיים של אינטראקציות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכינה מערכי נתונים ביולוגיים שעברו תיקוף עבור תהליכי סריקה ופיתוח בדיקות (assays) בהמשך הדרך.
- מבצעת סטנדרטיזציה של עיבוד הנתונים והפלט, ובכך משפרת את השחזוריות ואת היכולת להשוות בין בדיקות.
- מייצרת תוצאות כמותיות המתאימות לפלטפורמות להערכה של תרכובות בתפוקה גבוהה (high-throughput).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה (Aligns) של נתוני אינטראקציית RNA עם מערכות הרלוונטיות למחלה לצורך חקר ביומרקרים טרנסלציונליים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה בתובנות מכניסטיות חסונות.
- מפחית את הסיכונים הכרוכים בהחלטות על קידום הפיתוח על ידי הבהרת התפקוד של RNA רגולטורי בהקשרים ביולוגיים רלוונטיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
צינור העיבוד SCRAP משולב בממשק שבין ביולוגיה של גילוי לניתוח נתונים, ומגשר בין ריצוף בתפוקה גבוהה לתוצרי תיקוף של מטרות בעלות פוטנציאל יישומי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת השערות ובהבהרת מסלולים באמצעות מיפוי של אינטראקציות ישירות בין sncRNA ל-RNA מטרה.
- סריקה: מספק מערכי נתונים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות (assays) וסריקות המשך.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של אינטראקציות ותוצאות של peak-calling סטטיסטי לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני אינטראקציות למודלים של מחלות ולאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים כאשר הם מותאמים להקשר הביולוגי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע יכולת חישובית reutilizable ובקוד פתוח עבור תוכניות גילוי מגוונות המכוונות ל-RNA.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות RNA.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה חישוביים ומשפר את השחזוריות בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרה מוקדמת של תפקידי RNA רגולטורי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של נכסים המכוונים ל-RNA בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית בביולוגיה חישובית והיכרות עם כלי שורת פקודה.
- נדרשת התקנה של Git, Miniconda ותלויות כפי שפורט בפרוטוקול.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פורמטים של קבצי קלט ומבני ספריות.
- ניתן להתאמה למספר מינים באמצעות גנום ייחוס וקבצי אנוטציה מתאימים.
- תלוי בנתוני רצף באיכות גבוהה ובמטא-נתונים מדויקים של הדגימות לקבלת תוצאות אופטימליות.
