ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג תהליך שלם ומפורט ליישום RNA-Seq, טכנולוגיית ריצוף DNA רבת עוצמה מהדור הבא לפרופיל טרנסקריפטומים. זה מושג על ידי בידוד RNA כולל מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים עם או בלי טיפול בטרומבין ובדיקת איכות ה-RNA. השלב השני הוא בניית ספריות DNA מדגימות RNA אלה.

ייעל את יצירת האשכול באמצעות מכשיר ה-cbot ובצע את משימת ריצוף ה-DNA ב-HighSeq 1000. ניתוח הנתונים הבא מבוצע כדי לזהות ולהציג בסופו של דבר תעתיקי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. השלב האחרון הוא אימות תוצאות RN aeq על ידי RT, TP, CR. היתרון העיקרי של IC על פני שיטות קיימות כמו מערך מיקרו DNA לניתוח טרנסקריפטום הוא ש-IC יכול ליצור פרופיל של טרנסקריפטום שלם, לספק סוג דיגיטלי של נתונים, ולא להסתמך על שום איזציה גנומית ידועה של ביטוי גנים בתאים.

בעוד שמדידת רמת MRA היא כלי שימושי בקביעת האופן שבו שעתוק המכונות של התא מושפע מאותות חיצוניים או כיצד תאים שונים בין מצב בריאותי למצב מחלה. בפרוטוקול זה, נדגים ניתוח IC של טרנסקריפטומים בטרובין שטופלו ובקרת תאי הודו-סינתר מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים. פרוטוקול זה מבוסס על המחקר שפורסם לאחרונה בו ביצענו בהצלחה את ניתוח הטרנסקריפטום המלא הראשון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים שטופלו בתרומבין באמצעות RNA-Seq ב-High SEQ 1000, פלטפורמת ריצוף DNA פופולרית מהדור הבא.

באמצעות מערכת VS 7 R-T-P-C-R, ד"ר דנובה תדגים את הטיפול בתטרומבין בתאי ריאה אנושיים, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ובידוד RNA כולל של תאים.גב' מרגרט גיבסון תדגים את מערכת Experian לבדיקת איכות RNA וספריית DNA כמו גם יצירת אשכולות ב-cbot.

וד"ר דימיטרי גרגור ידגים ניתוח נתונים כדי להתחיל בתרבות פרוטוקול זו. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיות בין 90 ל-100% מפגש בשש צלחות באר ב-EGM שני בינוניים עם גורמי גדילה של 5% FBS ואנטיביוטיקה. החלף את המדיה למצע ההרעבה 30 דקות לפני הטיפול בתרומבין.

לאחר 30 דקות יש לטפל בתאים עם 0.05 יחידות למיליליטר, תרומבין, או להשאיר ללא טיפול כביקורת. דגרו על התאים במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר טיפול של שש שעות.

בודד את סך ה-RNA מהתאים המטופלים והביקורת באמצעות ערכת נירוונה בהתאם להוראות היצרן. העריכו את איכות ה-RNA עם שבב רנ"א אאוקריוטי בעל חוש סטנדרטי של Experian על פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת האלקטרופורזה האוטומטית של Experian. לבסוף, כמת את ה-RNA באמצעות שיטה פוטומטרית ספקטרו סטנדרטית לבניית ספרייה.

השתמש במיקרוגרם אחד של RNA כולל באיכות גבוהה לכל דגימה כחומר מוצא לבניית הספרייה. פעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי של היצרן. בפרוטוקול זה מבוצעים שני סבבים של פולי המכילים בחירות Mr.mRNA.

כדי להסיר את ה-RNA שלנו כדי למזער את ריצוף ה-RNA שלנו, העריכו את איכות הספריות באמצעות שבב Experian DNA one K. על פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת האלקטרופורזה האוטומטית של Experian. כמת את הספרייה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת.

בקיצור Q-R-T-P-C-R כמתואר בפרוטוקול הכתוב. בליווי סרטון זה, הפעל את ה-Q-R-T-P-C-R על פי פרוטוקול ה-MM הירוק של הסייבר וחשב את ריכוז המלאי המקורי של כל ספרייה. יש לדלל את מלאי הספרייה ל-10 ננו-מולאר ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.

כאשר מוכנים לאכול תא זרימה, הפשירו את לוחית המגיב cbot באמבט מים. CBOT הוא מכשיר המשמש לייעול תהליך יצירת האשכול. לאחר שטיפת מכשיר ה-cbot, דנטור את הספריות על ידי שילוב של 13 מיקרוליטר של XTE אחד ושישה מיקרוליטר של 10 ננו-מולר.

ספרייה לאחר מכן לצד כל צינור, הוסף מיקרוליטר אחד של נתרן הידרוקסיד רגיל אחד, מערבול את הצינורות מסתובבים למטה ודוגר אותו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן הניחו את הספריות המפורקות על קרח. לאחר מכן, יש לדלל את הספריות המפוקפקות עם מאגר הכלאה מקורר מראש על ידי שילוב של 996 מיקרוליטר של מאגר ו-4.0 מיקרוליטר של ספרייה מפוקפקת לריכוז סופי של 12 פיקו טוחנת.

הניחו את הספריות המדוללות המפורקות. לאחר מכן הפוך כל שורת צינורות של צלחת הבוט, וודא שכל הריאגנטים מופשרים. לאחר סיבוב הצלחת, הסר את אטם נייר הכסף משורת צינורות הנתרן הידרוקסיד והעמיס על ה-cbot aliquot.

120 מיקרוליטר מהספריות המדוללות שעברו דנטורציה לצינור רצועה המסומן אחת עד שמונה. הוסף 1.2 מיקרוליטר של ספריית הבקרה PHI X המדוללת לכל צינור כעלייה בשליטה. לאחר מערבולת וסיבוב הצינורות, טען אותם על ה-cbot בכיוון הנכון עם צינור מספר אחת מימין.

טען תא זרימה וסעפת על ה- cbot. השלם את בדיקת הזרימה והתחל את הפעלת האשכולות. לאחר השלמת ההפעלה, בדוק את אספקת הריאגנטים בכל הנתיבים.

רשום לעצמך חריגות. התחל את ריצת הריצוף מיד או אחסן את תא הזרימה בצינור המסופק בארבע מעלות צלזיוס. כדי להתחיל ברצף.

להפשיר את הרצף על ידי ריאגנטים לסינתזה. טען את הריאגנטים למקומות המתאימים במגשי הריאגנטים, הקפד לא לגעת בשאר הריאגנטים. לאחר נגיעה בתערובת המחשוף, באמצעות תא זרימה רצף שאינו ראש, קווי המגיב מנקים פעמיים ביסודיות את תא זרימת הריצוף עם 70% אתנול ומגבוני קים, ואחריהם 70% אתנול ונייר עדשות.

בדוק את תא הזרימה לאיתור פסים ונקה אותו מחדש במידת הצורך. טען את תא הזרימה על הרצף ובצע בדיקת זרימה כדי לוודא שהאיטום בין הסעפות לתא הזרימה הדוק. התחל את ריצת הרצף.

העריכו את מדדי האיכות כשהם הופכים לזמינים במהלך הריצה עקוב אחר עוצמת הריצה. לאחר השלמת 101 מחזורים. בצע כימיה מפנה כדי להשלים את הקריאה השנייה.

האב הראשון זיווג וריאגנטים, והשני קרא מאגר שילוב. לאחר מכן טען את הריאגנטים, המשך ברצף, הפעל הערכה. שנית, קרא את עוצמת הרבעון השלישי ומדדי איכות אחרים ככל שהריצה מתקדמת.

כדי להתחיל בניתוח נתונים, השתמש בגירסה העדכנית ביותר של קסאווה כדי להמיר את קבצי קריאת הבסיס לקבצי FAST Q. הגדרת ספירת אשכולות Q מהירה לאפס כדי להבטיח יצירת קובץ Q מהיר אחד. עבור כל דגימה, פתח את קבצי ה-Q המהירים לניתוח במורד הזרם.

בצע התאמה ויישור באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של הכובע העליון, המיישרת את קריאות RNA-Seq לגנומים בגודל יונקים באמצעות כלי קריאה קצרה ו-SAM בתפוקה גבוהה במיוחד, המיישמים כלי עזר שונים ליישור לאחר עיבוד בפורמט SAM. ניתן להוריד את הטרנסקריפטום האנושי ההתייחסות מהגנום I בכובע העליון הפועל נעשה שימוש בכל הגדרות הפרמטרים המוגדרות כברירת מחדל, כולל אפשרות סוג הספרייה כקטע לא תקוע באמצעות החלק ההבדלים של שרוול התוכנית בחבילת התוכנה cufflinks. השווה את התאים שטופלו בתטרומבין לתאי הביקורת.

סנן את תעתיקי הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בתאים שטופלו בתטרומבין על סמך טרנסקריפטום הייחוס האנושי. לאחר מכן השתמש בגיליון אלקטרוני כדי להמחיש את התוצאה בצורת טבלה. במקרה זה, נעשה שימוש בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים ואותם תעתיקי גנים עם FPKM קטן מ-0.05 ו-p גדול מ-0.05 סוננו החוצה כדי לזהות איזופורמים חדשים ללא הפניה.

טרנסקריפטום משווה את קבצי תמלול הדגימה לגנום הייחוס באמצעות השוואת שרוול. בדוק את הביטוי הדיפרנציאלי עם הבדל שרוול באמצעות קבצי תעתיק התרומבין המשולבים כגנום הייחוס לניתוח אחד וקבצי תעתיק הבקרה המשולבים כגנום הייחוס לניתוח שני, שוב, השתמש בגיליון אלקטרוני כדי לדמיין את התוצאה בפורמט טבלאי. כמו קודם, אותם תעתיקי גנים עם FPKM קטן מ-0.05 ו-p גדול מ-0.05 סוננו החוצה.

לאחר שלב זה, החוקרים עשויים לבחור להעלות רשימה של תמלילים שדווחו לאחרונה לאתר דפדפן הגנום של uc SC כדי לאמת את תקפותם על ידי בדיקה ידנית. ניתן גם להגיש רשימות של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי לניתוח מסלול המצאה לאפיון הגנים והמסלולים המושפעים מהטיפול בטרומבין. בשלב זה, החוקרים עשויים לבחור להשתמש ב-cummerbund חבילת R שנועדה לסייע ולפשט את המשימה של ניתוח פלט RN aeq של חפתים כדי לעזור לנהל, לדמיין ולשלב את כל הנתונים המופקים על ידי ניתוח הבדלים בשרוול.

לאחר מכן מבוצע אימות תוצאות ה-RN aeq על ידי Q-R-T-P-C-R תחילה, לבצע בידוד RNA כולל מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיות שטופלו בטרומבין, הערכת איכות RNA וכימות RNA כפי שהודגם קודם לכן בסרטון. לאחר מכן צור DNA משלים ממיקרוגרם אחד של RNA כולל של כל דגימה עם מערכת סינתזה של שלושה גדיל ראשון rt בהתאם להוראות היצרן. לבסוף, בצע ניתוח Q-R-T-P-C-R על מערכת PCR VI של שבעה בזמן אמת באמצעות נוקלאוטידים מתוכננים לפי דרישה של TAC MAN המפורטים בפרוטוקול הכתוב הנלווה לסרטון זה ומדדו כימות כמתואר שם.

היחס בין 28 שניות ל-18 S משמש באופן מסורתי כאינדיקטור לפירוק RNA כדי לכמת בצורה מדויקת יותר את הפירוק, מערכת החוויה מחשבת אינדיקטור איכות RNA או מספר RQI. אלגוריתם RQI משווה את האלקטרופרוגרמה של דגימות RNA לנתונים מסדרה של דגימות RNA מתוקננות ומחזיר אוטומטית מספר בין 10 לאחד. דגימת ה-RNA צריכה להיות בעלת RQI של לפחות שבע ובאופן אידיאלי גדול משמונה.

תוצאות Experian אלה מצביעות על דגימת RNA באיכות גבוהה עם RQI של 8.4. הספריות צריכות להיות בעלות פס רחב בכ-250 עד 300 זוגות בסיסים כפי שמוצג באיור זה של תוצאות Experian עבור ספרייה באיכות גבוהה. כאן מוצגות תוצאות Q-R-T-P-C-R של דגימות עקומה סטנדרטיות ודגימה אחת לא ידועה.

יש לעקוב כל הזמן אחר ההתקדמות והאיכות של ריצת הריצוף לאורך כל הריצה. איור זה מציג את צפיפות האשכול המתאימה במהלך שלב ההדמיה של המחזור הראשון. זו האינדיקציה הראשונה לריצה.

אשכולות איכותיים צריכים להיות בהירים וממוקדים. מוצגת דוגמה לדוח הבסיס הראשון שנוצר לאחר השלמת המחזור הראשון. חשוב להעריך את רמות העוצמה המשוערות של צפיפות האשכולות ואיכות המיקוד בשלב זה.

מחסום האיכות הבא לאחר המחזור הרביעי מוצג כאן. זה מראה את צפיפות האשכול המוחלטת עבור כל נתיב. צפיפות האשכול לא צריכה להיות מעל 850 K למילימטר מרובע לאחר מחזור 13.

נתונים סטטיסטיים של שלבים ושלבים מקדימים מחושבים. מספרים אופייניים הם בין 0.1 ל-0.25. הערכת האיכות העיקרית אפשרית לאחר מחזור 24 כאשר מחושבים מספר מדדי איכות.

אחוז הקריאות מעל הרבעון השלישי הוא מדד לביטחון בבסיס. קריאה עם ציון Q של שלוש פירושה שיש סיכוי של 1 ל-1000 שקריאת הבסיס שגויה. ציוני ה- Q יפחתו ככל שההפעלה מתקדמת, אך הם אמורים להתחיל עם יותר מ- 95% מהקריאות שנפגשות או עולות על Q3. האשכולות העוברים מסנן או pf הם האשכולות שמהם יילקחו נתוני הרצף בפועל.

באופן אידיאלי, זה צריך להיות מעל 85%האשכול pf מבוסס על גורמים רבים כולל שלבים, עוצמת קדם שלבים, Q3.It לא ישתנה ככל שהריצה מתקדמת. האחוז המיושר הוא מדד לקריאות שמתיישרות בזמן אמת לגנום FI x. מכיוון שספריית x של כ-1%FI הוכנסה לספריות המדגם, האחוז המיושר צריך להיות בין 0.5 ל-1.

נתון זה מראה כי תוכן הספרייה מיוצג היטב על ידי האשכולות ולא הייתה הטיית יצירת אשכולות המפורטים כאן הם גנים ואיזופורמים בקרה ובתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים שטופלו בתרופמבין. יש לציין כי זוהו כ-26,000 איזופורמים חדשים, מה שממחיש את חוזקו של RN aeq. זה יכול לזהות RNA לא ידועים.

לחלופין, תעתיקים מחוברים ושימוש במקדם חלופי, שאינם ניתנים לזיהוי על ידי טכניקות מיקרו-מערך. RNA-Seq יכול גם למדוד את התעתיקים הפחות נפוצים שזוהו באופן לא מדויק, מכומת או לא מזוהה על ידי מיקרו-מערכים כדי לאמת את תוצאות ה-RNA-Seq באמצעות גישה חלופית. ניסוי A-Q-R-T-P-C-R בוצע כדי לבחון שלושה גנים שונים בנתוני RNA-Seq TR אחד היה מווסת פי 7.96 עצמי.

אחד הורד פי 1.16 ותודה לשניים הפחית פי 1.70 בנתוני Q-R-T-P-C-R, המספרים המקבילים הללו הם פלוס פי 7.25 פחות פי 1.15 ופי 2.07 בהתאמה. התוצאות של שלושת הגנים הללו שנבדקו על ידי RNA-Seq ו-Q-R-T-P-C-R תואמות היטב, מה שמאשש את תוצאות ה-RNA-Seq. פרוטוקול זה הוא ספציפי ל-IC בנקודת זמן אחת של מיקרו-וסקולרי ריאתי אנושי שטופל בטרובין בתאים הבכירים, אך ניתן להתאים אותו בקלות למחקר רב-זמני או למחקרים ברקמות תאים אחרות שטופלו בגירויים או מעכבים שונים או השוואה של טרנסקריפטומים בתא או ברקמות בין מצב בריא למצב המחלה.

למרות שהוא ספציפי ל-SQ 1000 הגבוה, פרוטוקול זה ישים לכל אחד ממשפחת HighSeq או מנתח הגנום. שני מכשירים עם שינויים קלים בשלבי יצירת האשכול וריאגנטים לרצף. פלטפורמות ריצוף DNA אחרות מהדור הבא כגון הסדרה המוצקה.

מערכות ה-GS, כמו גם כמה מערכות חדשות יותר, משמשות גם הן למטרת RNA-Seq. למרות שנהלי בניית הספרייה והרצף שלהם עשויים להיות שונים במקצת, עצות הטיפול ב-RNA, חלקי ניתוח הנתונים והאימות על ידי R-T-P-C-R המוצגים בפרוטוקול זה יכולים להיות בעלי ערך ייחוס ליישומי ה-RNA-Seq שלהם.