צביעה אימונוהיסטוכימית מולטיפלקס לרקמת סרטן ריאות משובצת פרפין
21 בנובמבר 2023
פרוטוקול ניסיוני זה מתאר ומייעל שיטת צביעה של אימונוהיסטוכימיה מרובת אולמים (IHC), בעיקר על ידי אופטימיזציה של תנאי דגירה של נוגדנים חד-ערוציים והתאמת ההגדרות של נוגדנים ותעלות לפתרון בעיות של אוטופלואורסנציה ותקשורת צולבת ערוצים ברקמות סרטן ריאות ממוצא קליני.
המחקר שלנו התמקד במיטוב פרוטוקול mIHC על מקטע פרפין המתקבל ממקורות קליניים. מטרתנו הייתה לטפל ביעילות בבעיות אוטופלואורסנציה ואוטופלואורסנציה ברקמת הריאה. האתגרים הניסיוניים הנוכחיים העומדים בפנינו כרוכים בטיפול בבעיות של אוטופלואורסצנטיות ושיחות צולבות תעלות ברקמת ריאה, לפיהן השגת לוקליזציה פלואורסצנטית מרובת צבעים מוצלחת שהם זקוקים לה עבור תאי מטרה וחלבונים מסומנים.
שיטת הסימון היעילה ביותר שלנו לאנטיגן מרובה באתר, הדורשת פחות משלוש שעות לכל נוגדן, משלבת בצורה חלקה מערכת הדמיה מולטיספקטרלית ותוכנת פתולוגיה מיוחדת. פרוטוקול mIHC ממוטב זה ניתן להתאמה בקלות לשימוש במעבדות מחקר אחרות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול ניסיוני זה מתאר שיטה מותאמת לצביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) מולטיפלקס עבור רקמות של סרטן ריאה. הדגש הוא על טיפול בבעיות של פלואורסצנציה עצמית (autofluorescence) וסמיכה בין ערוצים (channel crosstalk) כדי לשפר את הוויזואליזציה של תאי המטרה והחלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- פתולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- אימונוהיסטוכימיה רב-ערוצית (mIHC) היא חיונית לחקר דגימות רקמה מורכבות.
- פלוֹרסצנציה עצמית עלולה להסתיר תוצאות בדימות פלוֹרסצנטי.
- דילוף בין ערוצים (Channel crosstalk) מקשה על פירוש של תמונות רב-ערוציות.
- אופטימיזציה של פרוטוקולי צביעה יכולה לשפר את בהירות התוצאות.
מטרת המחקר
- לאופטימיזציה של פרוטוקול ה-mIHC עבור רקמות של סרטן ריאה.
- לטיפול יעיל באוטופלורסצנציה ובדימום בין ערוצים (crosstalk).
- לפיתוח שיטה שניתנת להסתגלות במעבדות מחקר אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בדגימות רקמה של סרטן ריאה הטמיעות בפרפין.
- אופטימיזציה של תנאי אינקובציה לנוגדן בערוץ בודד.
- שילוב של מערכת רב-ספקטרלית מתקדמת.
- יישום של תוכנת פתולוגיה ייעודית לניתוח.
תוצאות עיקריות
- הפחתה מוצלחת של אוטופלורסצנציה ושל crosstalk בין ערוצים.
- תהליך צביעה יעיל הדורש פחות משלוש שעות לכל נוגדן.
- שיפור בלוקליזציה של תאי מטרה וחלבונים מסומנים.
- הפרוטוקול הפגין יכולת התאמה לסביבות מעבדה שונות.
מסקנות
- פרוטוקול ה-mIHC האופטימלי משפר משמעותית את בהירות הדמיון.
- טיפול באוטופלורסצנציה (autofluorescence) ובדיבדוף (crosstalk) הוא קריטי להשגת תוצאות מדויקות.
- שיטה זו עשויה לסייע למחקרים נוספים בפתולוגיה של סרטן ריאות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אימונוהיסטוכימיה רב-ערוצית (mIHC) מאפשרת פרופיל מרחבי בעל תוכן גבוה של ביטוי חלבונים ברקמות סרטן ריאה שטומנו בפרפין, ובכך נותנת מענה למורכבות של הסביבה המיקרוסקופית של הגידול. באמצעות פתרון בעיות של פלואורסצנציה עצמית וסמיכה בין ערוצים (crosstalk), פרוטוקול זה משפר את המהימנות של מיפוי סוגי תאים ומסלולים ביולוגיים, החיוניים לגילוי מוקדם ולמחקר תרגומי. השיטה תומכת בתיקוף יעילים של מטרות ובהערכת סמנים ביולוגיים, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח במחקר ופיתוח בתחום האונקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח עם רזולוציה מרחבית של ביטוי משותף של חלבונים בסביבות מיקרו של גידולים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות מועמדות באמצעות דטקציה מרובת רכיבים (multiplexed detection).
- משפר את הפחתת הסיכונים המכניסטיים על ידי הבהרת אינטראקציות בין-תאיות in situ.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת מסלולים ומטרות עבור תוכניות אונקולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות מבוססות רקמה שעברו תיקוף לצורך פיתוח בדיקות Multiplexed בהמשך התהליך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור מיקום ושפע של חלבונים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה לצביעת Multiplex בין צוותי מחקר שונים.
- תומך במוכנות לסריקה עבור פלטפורמות ניתוח רקמות בתפוקה גבוהה (high-throughput).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי תיקוף ביטוי חלבונים בדגימות קליניות.
- מבטיח המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תובנות של פתולוגיה מרחבית.
- מפחית סיכון תרגומי על ידי אישור חתימות חלבונים רלוונטיות למחלה in situ.
- תומך באינטגרציה עם נתוני ריצוף בעלת תפוקה גבוהה ונתוני פרוטאומיקה לצורך תיקוף מקיף.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול mIHC זה מתאים לשלבים השונים, החל מגילוי מוקדם ועד למחקר תרגומי, ומגשר בין תיקוף מטרות, פיתוח בדיקות והתאמה של ביומרקרים פרה-קליניים בקווי פיתוח בתחום האונקולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים באמצעות זיהוי חלבונים מרובה (multiplexed) ברקמות גידול.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים מרחביים בעלי תוכן גבוה לצורך ניתוח השוואתי של אוכלוסיות תאים וביטוי חלבונים.
- מחקר תרגומי: מתקפת ביומרקרים רלוונטיים למחלה ותומכת באינטגרציה עם מערכי נתוני omics.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול סקילבילי וסתגלן עבור סוגי רקמות שונים ומסגרות מחקר מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות ובסמנים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה של צביעה רב-ערוצית (multiplex) סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון באמצעות מתן תובנות ביולוגיות מרחביות חסונות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של נכסי אונקולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה ובניתוח דימות פלואורסצנטי.
- נדרשת גישה למערכות דימות מולטי-ספקטרליות ולתוכנות פתולוגיה ייעודיות.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך שחזור הפרוטוקול והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה לסוגי רקמות שונים הטמיעות בפרפין באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- חובה לטפל באוטופלואורסצנציה ובדימום בין ערוצים (crosstalk) לצורך זיהוי מולטיפלקס מדויק.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:17
Optimizing Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Staining for Lung Cancer Tissue Samples to Address Autofluorescence Issues
3:38
Analyzing Fluorescence in Lung Cancer Tissue Samples Stained with Optimized Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Technique
