יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה
10 בנובמבר 2023
היישום של שכבות תמיכה ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM) יכול להגדיל את צפיפות החלקיקים, להגביל אינטראקציות עם ממשק אוויר-מים, להפחית תנועה הנגרמת על ידי אלומה, ולשפר את התפלגות כיווני החלקיקים. מאמר זה מתאר פרוטוקול חזק לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחת של גרפן לשיפור הכנת דגימת קריו.
אתגר נפוץ בהכנת דגימות במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים הוא לוקליזציה של חלקיקים בממשק אוויר-מים, מה שגורם לחלקיקים לאמץ אוריינטציות מועדפות ודה-נטורציה. במקום זאת, עדיף להניח את החלקיקים על משטח הרשת, אשר סרט דק תומך, כמו גרפן מקדם. אתגר נוסף הוא הדרישה לריכוזי דגימה גבוהים יחסית, שגם אליהם ניתן לטפל באמצעות גרפן.
רשתות מצופות גרפן מספקות יתרונות רבים לקביעת מבנה cryoEM, אך מבחינה היסטורית היה קשה לייצר אותן בתוך החברה באופן שניתן לשחזר, כמו גם עלות אסורה לרכישה מסחרית. פרוטוקול זה מאפשר שיקוע חזק של גרפן חד-שכבתי, ובכך מוריד את המחסום למשתמשים המשתמשים ברשתות אלה במחקר שלהם. גרפן הוא ייחודי בגלל התכונות החומריות שלו.
זוהי שכבה חד-שכבתית של פחמן ולכן מפגינה רעשי רקע מינימליים. תומכי רשת cryoEM אחרים כגון שכבה דקה של פתיתי פחמן אמורפי או תחמוצת גרפן אינם ניתנים ליישום כשכבה אחת ותורמים יותר אות רקע. כעת, לאחר שהקמנו פרוטוקול חזק ליישום גרפן ברשתות cryoEM, ברצוננו להמשיך בפונקציונליזציה של רשתות מצופות גרפן עם ידיות זיקה ללכידה ברשת ישירות מליזטים של תאים.
זה יכול להקל על צוואר בקבוק נוסף בהכנת דגימות cryoEM.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לציפוי סריגי מיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית (cryoEM) בשכבה אחת של גרפן. השימוש בגרפן מגביר את צפיפות החלקיקים, ממזער אינטראקציות עם הממשק שבין האוויר למים, ומשפר את התפלגות האוריינטציה של החלקיקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית
- מדע החומרים
- טכניקות להכנת דגימות
רקע
- מיקום של חלקיקים בממשק האוויר-מים מהווה אתגר נפוץ ב-cryo-EM.
- אוריינטציות מועדפות עלולות להוביל לדנטורציה של חלקיקים.
- תמיכות גרפית יכולות לסייע לחלקיקים להישען על פני השטח של הגריד.
- מבחינה היסטורית, ייצור של גרידים מצויי גרפית היה קשה ויקר.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול חסון להשקעת גרפן בשכבה אחת (monolayer graphene) על גרידים של cryoEM.
- הנמכת החסמים בפני חוקרים המעוניינים להשתמש בגרידים מצופים גרפן.
- שיפור היתרונות של קביעת מבנה באמצעות cryo-EM.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח פרוטוקול לציפוי גרפן.
- הערכת צפיפות החלקיקים והאוריינטציה שלהם.
- השוואה בין רשתות מצופות גרפן לרשתות מסורתיות.
- הערכת השחזוריות בייצור הרשתות.
תוצאות עיקריות
- רשתות מצופות גרפן משפרות משמעותית את מיקום החלקיקים.
- צפיפות חלקיקים מוגברת מאפשרת קביעה טובה יותר של המבנה.
- פרוטוקול חסון מקל על ייצור עצמי של רשתות גרפן במעבדה.
- עלויות נמוכות יותר ונגישות משופרת עבור חוקרים.
מסקנות
- השימוש בגרפן ברשתות cryo-EM נותן מענה לאתגרים מרכזיים בהכנת דגימות.
- פרוטוקול זה מאפשר אימוץ רחב יותר של רשתות מצופות גרפן במחקר.
- התכונות הייחודיות של הגרפן משפרות את יכולות ה-cryo-EM.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
צווארי בקבוק בהכנת דגימות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryoEM) מגבילים את התפוקה ואת המהימנות של קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה בקווי תהליכי הגילוי המוקדם והביולוגיה המבנית. יישום של גרפן בשכבה אחת (monolayer graphene) על רשתות cryoEM נותן מענה לאתגרים קריטיים של מיקום חלקיקים, הטיות אוריינטציה ודרישות ריכוז דגימה, ובכך משפיע ישירות על רמת הביטחון בחיזויים של תיקוף מטרות ומחקרים מכניסטיים. פרוטוקולים חסונים וניתנים לשחזור של רשתות גרפן מאפשרים אימוץ רחב יותר ברמה הארגונית, ותומכים בקידום פורטפוליו מותאם סיכונים ובהקצאת משאבים יעילה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מבנית ברמת דיוק גבוהה של מטרות מקרו-מולקולריות ברזולוציה קרובה לרמה אטומית.
- מפחית דנטורציה של הדגימה והטיה של האוריינטציה, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים.
- מקל על תיקוף בטוח של המטרה על ידי שיפור צפיפות החלקיקים ועקביות הדימוי.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין תומכי רשת (grid supports) סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור תהליכי עבודה המשכיים של cryoEM.
- משפר את מהימנות הבדיקה על ידי מזעור רעשי הרקע ושיפור תוצרי הדמיя הכמותית.
- תומך בסריקה ניתנת להרחבה של קומפלקסים מגוונים מבחינה מבנית בריכוזי דגימה נמוכים יותר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר מחקרים מבניים של קומפלקסים הרלוונטיים למחלה, ובכך תומך בהלימה של ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רציפות משלב פענוח המבנה בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנונים מולקולריים.
- מפחית את הסיכון לכשל ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי הבטחת איכות הנתונים המבניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הכנת רשת גרפן בשכבה אחת (Monolayer graphene) משתלבת בתהליך העבודה של cryoEM, החל משלב הגילוי המוקדם ועד לזיהוי מובילים ומחקר פרה-קליני, ובכך תומכת בקביעת מבנה מבוססת היפותזה ובהבנה מכניסטית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקה חסונה של השערת האפס על ידי מתן אפשרות להשוואות מבניות מדויקות בין תנאים שונים.
- סריקה: מספק רשתות הניתנות לשחזור עם רקע נמוך לצורך דימות כמותי וסטנדרטיזציה של בדיקות.
- אנליטיקה: מספק תבניות עקיפה ומפות צפיפות באיכות גבוהה לצורך ניתוח סטטיסטי וקבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: שומר על רציפות של נתונים מבניים עבור מטרות וקומפלקסים הרלוונטיים למחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת סקילבילית וניתנת לשחזור להכנת רשתות עבור תוכניות מו"פ מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מבנה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הכנת הגריד, משפר את השחזוריות ומפחית את דרישות הכמות של הדגימות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי הפחתת צווארי בקבוק בהכנת הדגימות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של מטרות המאומתות מבנית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בגרפן ובהכנת רשתות ל-cryoEM.
- נדרשת גישה למסבבי ציפוי (spin coaters), ליחידות פריקה חשמלית (glow discharge units) ולמנקי UV-אוזון.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית לצורך הדירות והשוואתיות של נתונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מערכות מקרו-מולקולריות שונות או סוגי דגימות שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הטיפול בשבירות ואת הבטחת שלמות השכבה החד-שכבתיות (monolayer) במהלך ההעברה.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
