גישה מיקרופלואידית לפתרון הפרשת ציטוקינים סימולטנית ורציפה של תאים רב-תפקודיים בודדים
8 במרץ 2024
הפרוטוקול מתאר פלטפורמה מיקרופלואידית מתקדמת למדידה כמותית של דינמיקת הפרשת ציטוקינים של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים בודדים. הפלטפורמה מודדת עד שלושה ציטוקינים במקביל (IL-6, TNFα ו-IL-1β) עבור כל תא בודד המגורה באמצעות ליפופוליסכריד כדוגמה.
בפרויקט זה אנו מתמקדים בפיתוח ויישום אסטרטגיות אנליטיות חדשניות, המאפשרות ניתוח ישיר, כמותי ועמוק של תפקודים תאיים ברזולוציה של תא יחיד. וכך, על ידי מעבר למדידה טהורה של נקודת נתונים אחת, אנו שואפים להבין טוב יותר ולנצל את הרב-פונקציונליות הזו, שמגיעה מתגובות מורכבות במארח וברקמות. כדי להשיג הבנה מקיפה של פונקציות אלה הוא מורכב, קשה, ודורש גישות בין-תחומיות.
ולכן אחד האתגרים בהקשר זה הוא להבטיח שהטווח הדינמי של הבדיקה שהתפתחה מתאים כדי ללכוד את הכמות והדינמיקה של חלבון מופרש, שיכולה להשתנות מאוד בין דגימות, תכשירים ורקמות. הפרעה בוויסות התגובה החיסונית עלולה לגרום להפרעות שונות, מה שמוביל לחום קל לסיבוך שעלול לסכן חיים. מעבר למדידות מסורתיות של נקודות קצה, הצענו למדוד ישירות את חוסר הוויסות וההפעלה של תאי מערכת החיסון באופן דינמי ברמת תא בודד כדי לקבל תובנות נוספות.
אז ציטוקינים מזוהים בדרך כלל בנקודת הזמן הספציפית כריכוז בסופרנאטנט או ריכוז של תאים פעילים. מדידה בתפזורת ישירות לכימות ההפרשה של כל תא בודד, תוך מיסוך הטרוגניות תאית אשר, כמדידות קצה, אינן מבחינות בין הפרשה סימולטנית למשנית. התעלמות מההיבט הדינמי של התגובה תפקוד תאי מלא מתייחס ליכולתו של תא החיסון להפריש ציטוקינים מרובים בו זמנית.
זה מאפשר להם לכוונן את התגובה שלהם נגד איומים, למשל, ולמדוד את פונקציונליות הפולי הזו באופן דינמי, כלומר לאורך זמן יכול לתת תובנות יתר על המידה לגבי הניואנסים השונים של תגובה חיסונית.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פלטפורמה מיקרופלואידית מתקדמת שתוכננה למדידה כמותית של דינמיקת הפרשת ציטוקינים ברמת התא הבודד. הפלטפורמה מאפשרת מדידה סימולטנית של שלושה ציטוקינים (IL-6, TNFα, ו-IL-1β) מתאים בודדים של תאי דם לבנים מונונוקלאריים פריפריים של בני אדם שעברו סטימולציה באמצעות ליפופוליסכריד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- מיקרופלואידיקה
רקע
- הבנת הדינמיקה של ציטוקינים היא חיונית לקבלת תובנות לגבי תגובות חיסוניות.
- שיטות מסורתיות נוטות להתעלם מההטרוגניות התאית וממתגובות דינמיות.
- ניתוח של תא בודד מספק הבנה מעמיקה יותר של התפקוד של תאי מערכת החיסון.
- שיבוש בבקרה החיסונית עלול להוביל להפרעות שונות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למדידה בזמן אמת של הפרשת ציטוקינים ברמת התא הבודד.
- לכידה של הטווח הדינמי של הפרשת ציטוקינים במדגמים שונים.
- שיפור ההבנה של פוליפונקציונליות של תאי מערכת החיסון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון שבב מיקרופלואידי לניתוח של תא בודד.
- שימוש בננו-חלקיקים פונקציונליים לזיהוי ציטוקינים.
- בקרת זרימה דינמית להקמת ייצור יציב של טיפות.
- מדידה כמותית של הפרשת ציטוקינים לאורך זמן.
תוצאות עיקריות
- הפלטפורמה מודדת בהצלחה הפרשת ציטוקינים מתאים בודדים.
- הושגה זיהוי סימולטני של מספר ציטוקינים.
- ניתוח דינמי חשף תובנות לגבי תגובות של תאי מערכת החיסון.
- התוצאות מצביעות על חשיבותן של מדידות ברמה של תא בודד באימונולוגיה.
מסקנות
- הפלטפורמה מיקרו-פלואידית שפותחה היא כלי בעל ערך למחקר אימונולוגי.
- ניתוח של תאים בודדים יכול לספק תובנות קריטיות לגבי התנהגות תאי מערכת החיסון.
- גישה זו עשויה להוביל להבנה טובה יותר של הפרעות הקשורות למערכת החיסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פתרון בעיית ההפרשה הסימולטנית והסדרתית של ציטוקינים ברזולוציית תא בודד נותן מענה לפער קריטי באפיון התגובה החיסונית לצורך גילוי תרופות. פלטפורמת טיפות המיקרופלואידיקה זו מאפשרת ניתוח כמותי ורזולוציית זמן של תאים חיסוניים פולי-פונקציונליים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי של אימות מטרות והפחתת סיכונים מכניסטיים. המודולריות ויכולת המולטיפלקס שלה ממצבות אותה כנכס רב-פעמי עבור צינורות מו"פ המתמקדים באימנולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בדיקה ישירה של פולי-פונקציונליות של תאי מערכת החיסון ומעורבות של נתיבי ציטוקינים.
- תומכת בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין הפרשה סימולטנית להפרשה רצפית של ציטוקינים ברמת התא הבודד.
- משפרת את רמת הביטחון החיזויית בבחירת מטרות חיסוניות ובמיון של מנגנונים מועמדים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין בדיקות תאי-בודד (single-cell assays) רב-ערוציות (multiplexed) ומתוקתקות עבור תהליכי סריקת תרכובות בהמשך הדרך.
- מספק מדידות כמותיות של ציטוקינים ברזולוציית זמן לצורך סטנדרטיזציה של תוצרי הבדיקה.
- מאפשר זיהוי הדיר שחזור של הטרוגניות פנוטיפית באוכלוסיות של תאי מערכת החיסון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים חיסוניים רלוונטיים למחלה על ידי לכידה של יחסי הגומלין הדינמיים של ציטוקינים בתאים אנושיים ראשוניים.
- מאפשר גילוי של ביומרקרים תרגומיים באמצעות פרופילים של הפרשה ברמה של תא בודד עם תוכן גבוה.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי חשיפת הגетеרוגניות חיסונית תפקודית הרלוונטית לתגובה טיפולית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פלטפורמה מיקרופלואידית זו משלבת תהליכים החל משלב הגילוי המוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ומגשרת בין תיקוף מטרות חיסוניות מונחה-השערה לזיהוי סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- ביולוגיית גילוי: מכמת הפרשת ציטוקינים דינמית כדי להבהיר את הפעלת המסלולים החיסוניים ולהפחית סיכונים בהשערות לגבי מטרות טיפוליות.
- סריקה: מספקת תוצאות של בדיקת תא בודד (single-cell assay) רב-ערוצית וניתנת לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות כמותיות ברזולוציית זמן המאפשרות השוואה איתנה של תגובות תאי מערכת החיסון.
- מחקר תרגומי: מקשר בין דינמיקת הפרשה בתא בודד לבין מודולציה חיסונית הרלוונטית למחלה ואסטרטגיות של סמני ביולוגים (biomarkers).
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית וניתנת להתאמה לניתוחים של דגימות חלבונים ותאים מגוונות תחת תוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכנית בתיקוף של מטרות חיסוניות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה והרחבה של בדיקות ציטוקינים ברמת התא הבודד ליצירת נתונים בעלי תוכן גבוה וניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go והתקדמות יעילה של פורטפוליו הון על ידי חשיפת הטרוגניות חיסונית תפקודית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום נכסים ממוקדי אימונולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרופלואידיקה, פיתוח בדיקות אימונו-סריקה (immunoassay) וניתוח תמונות כמותי.
- מחייב גישה למיקרוסקופיית פלואורסצנציה ותשתית דימוג אוטומטית.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של כיול הבדיקה ותהליכי העבודה לניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה לציטוקינים ולסוגי תאים שונים באמצעות הגדרה מחדש של הבדיקה.
- יש לתקף את הטווח הדינמי והרגישות עבור כל יישום חדש או סוג דגימה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Observation Chamber Fabrication for Imaging Single‐Cell Suspensions and Magnetic Nanoparticles
3:50
Preparation of Functionalized Magnetic Nanoparticles for Time‐Resolved Fluorescent Imaging
5:33
Encapsulation of the Cells and Nanoparticles into Droplets for Fluorescent Imaging
