יישומים Microfluidic עבור אבחון פנויה
3 בפברואר 2008
בראיון זה, ד"ר Klapperich דן תרמופלסטיים ייצור של מכשירים microfluidic ויישומם לפיתוח של כלי אבחון חדשים.
שמי קתרין קלאודברידג' (Catherine CloudBridge) ואני פרופסור לייצור, הנדסה והנדסה ביו-במדית באוניברסיטת בוסטון. כמו כן, אני מנהלת את המעבדה למכשירים ביו-במדיים זעירים וסביבות מיקרו. אנו עוסקים בעיקר בפיתוח אמצעי אבחון חד-פעמיים ליישומים בסביבות עם משאבים מוגבלים.
לכן אנו משתמשים במיקרופלואידיקה כדי לייצר את ההתקנים הללו. אנו מעוניינים למעשה בשני תחומי מחקר. בראש ובראשונה, אנו מעוניינים לבחון כיצד ביו-מולקולות ותאים מגיבים למשטחי פולימרים פלסטיים.
זוהי מסגרת העל המרכזית שלנו. עבודה זו באה לידי ביטוי ביישומים מיקרופלואידיים לאבחונים חד-פעמיים. לכן, במעבדה, אנו מייצרים התקנים מיקרופלואידיים.
בחומרים תרמופלסטיים איננו משתמשים, בדרך כלל, ב-PDMS, שהוא החומר הגומי שרוב האנשים משתמשים בו כדי ליצור מערכות מיקרופלואידיקה במעבדה. אנו מייצרים את המכשירים שלנו מחומרים תרמופלסטיים. אנו מעוניינים להשתמש במכשירים תרמופלסטיים אלה כדי לבצע ביולוגיה מולקולרית בקנה מידה מיקרוסקופי, באופן שיאפשר ביצוע של ביולוגיה מולקולרית בשטח, הרחק ממעבדה מרכזית.
האופן שבו זה מיושם במעבדה הוא שאנו מייצרים כרטיסי פלסטיק קטנים, ובתוך כרטיסים אלו נמצאות עמודי מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction), עמודי ליזיס של תאים או עמודי ערבוב. אנו מבצעים גם תגובת שרשרת פולימראז (polymerase chain reaction) על השבב כטכניקת זיהוי. כל הרכיבים הללו מאוגדים למכשיר קטן שבטווח הרחוק של המחקר יהפוך למכשיר אינטגרטיבי שניתן יהיה להחזיקו ביד ולהוציאו לשטח או לסביבות שבהן מעבדה רחבת היקף, עם כל מכשירי הסנטריפוגה, האינקובטורים לחימום וכדומה, לא תהיה זמינה.
לכן, השאיפה שלנו היא להיות מסוגלים להתחיל מדגם אנושי, כגון דם, שתן, צואה או למשל סוואב נזופרינגיאלי, שיהיה מורכב מרירי. ובמוצא של השבב לקבל תשובה, כן או לא, האם אדם נגפה במיקרואורגניזם מסוים. אנו עושים זאת על ידי חיפוש ה-DNA או ה-RNA של אותו מיקרואורגניזם ספציפי, תלוי בסוג המיקרואורגניזם, בתוך דגימת המטופל.
לפיכך, האתגרים הטכניים שמתעוררים נמצאים בעיקר בצד של הכנת הדגימה במשוואה זו. כאשר מתחילים עם דם, צואה או שתן, עליך להגיע ממצב שבו יש לך דגימה אנושית מורכבת, המכילה כמות גדולה של חלקיקים פוטנציאליים או מעכבים של PCR או של טכניקות הגברה אחרות, למצב שבו בסוף התהליך תהיה דגימה נקייה מאוד של חומצות גרעין שחולצו, שניתן להשתמש בהן להגברה או לחיפוש אחר DNA או RNA ספציפיים שיעידו אם המיקרואורגניזם שאתה מחפש היה נוכח.
כדי לנקות את הדגימות הללו, יש לבצע מספר פעולות. ראשית, יש לסנן את הדגימה, תהליך אשר בהתאם לסוג הדגימה, עשוי לכלול סינון גס או שלב של סבב מהיר (spin) לפני שהדגימה מועברת לשבב. לכן, אנו תמיד שואפים להתחיל עם הדגימות כפי שהן מתקבלות מהקליניקאי.
לכן, עבור דגימות שתן, צואה ומטוחי נזל-לוע, המטרה שלנו היא שהקליניקאי פשוט יבצע את עבודתו כפי שהוא רגיל ויגבה את הדגימה כפי שהוא רגיל. לאחר מכן, אנו לוקחים את הדגימה ומניחים אותה על השבבים. לפיכך, אם נדרש סינון נוסף בשלב זה, הסינון יתבצע בתוך השבב.
השלב השני כולל, מכיוון שאנו מבצעים בדיקות מולקולריות, את הצורך בליס (lyse) של התאים והמיקרואורגניזמים הנמצאים בדגימה זו. לכן אנו מבצעים שלב ליסיס, הכולל בדרך כלל דחיפה של הדגימה דרך מסנן בעל נקביות קטנות. לעיתים המסנן מכיל גם ננו-חלקיקים כגון ננו-צינוריות פחמן, בעלות קצוות חדים, שיכולים לשמש לפירוק של חלק מהאורגניזמים בעלי דפנות תאים עמידות יותר כמו C difficile, שהיא חיידק גרם-חיובי שאיתו אנו עובדים והוא קשה מאוד לליסיס.
לכן עלינו להשתמש בעמודי ליזיס עמידים יותר. אך בדרך כלל אנו מבצעים ליזיס כימי ומכני משולב בתוך השבב. לאחר מכן, מטרתנו היא לקחת את הליזט ולאחר מכן להוציא את החומצות הגרעיניות המזוהות.
כעת אנו מעבירים את הליזאט על פני עמודת מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction column) המשובצת בשבב המיקרופלואידי. עמודת מיצוי פאזה מוצקה זו עשויה מפלסטיק ומיוצרת באמצעות כימיה בעירור פוטו-כימי בתוך התעלה המיקרופלואידית לאחר שהיא כבר יוצרה. בנוסף, היא ספוגה בדרך כלל בחלקיקי סיליקה, מכיוון שאנו מעוניינים לקשור ולשחרר חומצות גרעיניות.
במקרים מסוימים, שילבנו גלובוליות oligo DT אם ברצוננו לקשור ולשחרר mRNA באופן ספציפי, למשל, או גלובוליות הנושאות נוגדנים ספציפיים, אם ברצוננו לקשור ולשחרר חלבונים מסוימים. ואנו יכולים להכין עמודי מיצוי המבצעים את כל הפעולות הללו. אך היום נראה לכם כיצד להכין את עמוד המיצוי של sase עם גלובוליות סיליקה.
לאחר שביצענו זאת, מעבירים את הליזט דרך עמודת הסיליקה; התהליך עובד בדיוק כפי שעובד ערכה של Qiagen במעבדה בקנה מידה מאקרוסקופי. לאחר מכן נבצע שטיפה כדי להסיר את כל שאר הרכיבים שאינם רצויים, את כל הפחמימות, הליפידים וחומרים אחרים הנמצאים בליזט התאי ובשאר הדגימה האנושית שאיננו מעוניינים בהם. ובסוף התהליך, נבצע אלוציה באמצעות מים.
והיתרון בעמודי מיסור של פאזה מוצקה (solid phase extraction) במיקרו-קנה מידה הוא שניתן לבצע אלucia עם כמות קטנה מאוד של מים, בדרך כלל בסדר גודל של 1 עד 5 µL. אנו מקבלים בחזרה כמעט את כל החומצות הגרעיניות שהכנסנו. קצב היעילות הוא כ-70% עד 90% ב-10 µL הראשונים שאנו מקבלים בחזרה מהתעלה הזו.
לכן, אם נבצע שטיפה כפולה עם 2 עד 10 µL, נקבל בחזרה כמעט את כל החומצות הגרעיניות שהכנסנו. כך מקבלים לא רק דגימה נקייה שניתן להריץ לה PCR, אלא גם דגימה בריכוז גבוה בהרבה מזה שניתן להשיג באמצעות ערכה סטנדרטית לשולחן המעבדה. המטרה הסופית של כל טכניקות הכנת הדגימות הללו היא ליצור תוצרים התואמים לחלק מהעבודות האחרות שבוצעו בתחום.
עבודה מרשימה מאוד בתחום, המראה שניתן לבצע הגברת PCR על גבי שבב. ניתן לבצע את תגובת ה-reverse transcriptase על גבי שבב אם אתם עוסקים בנגיף RNA או אם ברצונכם לבצע ניסוי של ביטוי גנים. ניתן לשלב את טכניקות הכנת הדגימות שלנו ישירות עם PCR על גבי שבב, כך שלא תצטרכו לבצע אף אחד משלבי הניקוי וההכנה של הדגימה על השולחן.
בנוסף, ישנו שלב הריכוז שעליכם לבצע כדי להשיג את הנפחים הזעירים הדרושים לביצוע PCR רב-מיקוד (multiplexed PCR) על שבב קטן. לכן, הניסויים שנציג בפניכם היום ידגימו כיצד אנו מרכיבים את השבב המיקרופלואידי, העשוי מתרמופלסטי ולא מ-PDMS. לכן, הוא דורש תהליך ייצור שונה מעט מהמקובל, וכן נראה כיצד שבבים אלו נסגרים.
ולאחר מכן כיצד אנו מבצעים את הכימיה בהשראת אור בתוך השבב כדי ליצור את המונולית הפולימרית המשמשת הן לליזיס של תאים והן לחילוץ פאזה מוצקה. ובסוף תהליך זה, שכרגע מדובר בתהליכים מודולריים במעבדה, אך הם יכולים ולהיושמו באופן אינטגרטיבי, תתקבל דגימה מרוכזת מאוד של חומצות גרעיניות, RNA ו-DNA במים, שיכולה לעבור לאחר מכן למודול PCR או למודול הגברה אחר שבו ניתן לבצע זיהוי של מיקרואורגניזם או זיהום. למעשה, יש לנו מענק שאנו עובדים עליו כעת, שבו התחלנו לאסוף דגימות אנושיות מהמרכז הרפואי של בוסטון מחולים שייתכן שהם נגועים בשפעת A או שלא. כיוון שזו עונת השפעת, אלו הן הדגימות שאנו אוספים.
ואז במעבדה, אנו מבצעים את בדיקות ה-gold standard כדי לבדוק אם אדם נגוע ב-Influenza A, שזוהי בעיקר בדיקת תרבית, אשר לביצועה נדרשים מספר ימים. ובמקביל לכך, אנו מעבירים את הדגימות הללו דרך המודולים של השבב שלנו. אנו מעבירים אותן דרך עמודת הליזיס, דרך עמודת מיצוי הפאזה המוצקה (solid phase extraction), ולאחר מכן אנו מבצעים את ה-PCR כדי לבחון את רמת הביצועים שלנו בהשוואה לשיטות ה-gold standard.
זהו השלב שבו אנחנו נמצאים כעת. אם ניסויים אלו יצליחו, אני חושב שבמהלך ארבע עד שש השנים הבאות, אולי נגיע למצב שבו יהיה לנו שבב משולב ובדיקה מלאה עבור influenza A, ובנוסף אנו עובדים על clostridium difficile ודגימות צואה. ואנחנו גם קרובים מאוד לא רק לשילוב המכשיר, אלא גם לשילוב הבדיקה.
לפיכך, פיתוח הבדיקה ותכנון השבב חייבים להתרחש במקביל. עבור יישום מסוים, במטרה להגיע לשימוש במיטת החולה, מדובר בתהליך המכוון למטרה. עליך להכיר את הדגימה ממנה אתה מתחיל ואת המיקרואורגניזם שאתה מחפש כדי לבצע אופטימיזציה לשבב לצורך שימוש במיטת החולה.
אז אני, אני לא חושב שאנחנו רחוקים כל כך מלהוציא את זה אל הפועל כפרוטוטיפ. אלו הן מטרות הסוף שלנו, כך שאני מקווה שנגיע לשם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ראיון זה עם ד"ר Catherine Klapperich בוחן את הייצור והיישום של מכשירים מיקרופלואידיים תרמופלסטיים עבור אבחון חד-פעמי, במיוחד בסביבות עם משאבים מוגבלים. הדיון מדגיש את השילוב של הכנת דגימות, מיצוי חומצות גרעיניות וזיהוי מולקולרי בתוך מכשירים קומפקטיים הניתנים לפריסה בשטח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- הנדסה ביומדית
- מיקרופלואידיקה
- פיתוח מכשירים אבחנתיים
רקע
- אבחון רפואי חד-פעמי הוא חיוני למתן שירותי בריאות בסביבות עם משאבים מוגבלים.
- התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים עיבוד ואנליזה של דגימות באופן מיניאטורי ואינטגרטיבי.
- מיקרופלואידיקה מסורתית משתמשת לעיתים קרובות ב-PDMS, אך פלסטיקה תרמופלסטית מציעה יתרונות לייצור המוני ולשימוש בשטח.
- הכנה יעילה של דגימות ומיצוי חומצות גרעיים הם אתגרים מרכזיים לאבחון מולקולרי.
מטרת המחקר
- פיתוח התקני מיקרופלואידיקה תרמופלסטיים עבור אבחון מהיר הניתן לפריסה בשטח.
- שילוב של הכנת דגימה, מיצוי חומצות גרעין וזיהוי מולקולרי על גבי שבב בודד.
- מתן אפשרות לניתוח ישיר של דגימות קליניות (למשל, דם, שתן, צואה, מטושים) ללא תשתית מעבדה נרחבת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור שבבים מיקרופלואידיים מחומרים תרמופלסטיים (לא PDMS).
- שילוב של עמודי מיצוי פאזה מוצקה ועמודי ליזיס בתוך השבב.
- שימוש בכימיה המופעלת על ידי אור ליצירת מונוליטים פולימריים למיצוי וליזיס.
- הטמעה של חרוזי סיליקה או חלקיקים פונקציונליים לקישור סלקטיבי של חומצות גרעיניות או חלבונים.
- ביצוע PCR ושעתוק הפוך על גבי השבב לצורך גילוי מולקולרי.
תוצאות עיקריות
- מיצוי יעיל של חומצות גרעיניות (השבה של 70–90%) בנפחי אלucian קטנים (1–5 µL).
- הפקת דגימות ריכוז גבוה המוכנות ל-PCR ישירות מדגימות קליניות.
- תאימות מוכחת של מודולים להכנת דגימות עם PCR on-chip המשכי.
- תיקוף מתמשך עם דגימות קליניות עבור Influenza A ו-Clostridium difficile.
מסקנות
- התקנים מיקרופלואידיים תרמופלסטיים יכולים לייעל את הכנת הדגימות ואת האבחון המולקולרי בפורמטים ניידים.
- לשבבים אינטגרליים יש פוטנציאל לספק תוצאות מהירות ומדויקות בנקודת הטיפול (point of care).
- פיתוחים עתידיים שואפים לאינטגרציה מלאה של הבדיקות ושל תכנון ההתקן עבור יישומים אבחוניים לצמידי-מיטה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
התקני מיקרופלואידיקה מתרמופלסטיים מאפשרים אבחון מסוג "מדגם-לתשובה" (sample-to-answer) בסביבות עם משאבים מוגבלים, על ידי שילוב של ליזיס, מיצוי חומצות גרעין והגברה על פלטפורמה חד-פעמית אחת. גישה זו מפחיתה את ההסתמכות על מעבדות מרכזיות ותומכת בזיהוי מהיר של מחלות זיהומיות בנקודת הטיפול (point of care). הטכנולוגיה משפרת את הביטחון החזוי בגילוי מוקדם על ידי אספקת פלטי חומצות גרעין מרוכזים וניתנים לשחזור, התואמים ל-PCR או להגברה איזותרמית בהמשך התהליך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של אינטראקציות בין מאחס לפתוגן באמצעות הפקת חומצות גרעין מופרשות מדגימות קליניות מורכבות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת חומצות גרעין נקיות ממעכבים עבור בדיקות תיקוף מטרות בהמשך התהליך.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מפיק תמרירי חומצות גרעין בריכוז גבוה (יעילות של 70-90%) המתאימים לסריקת multiplexed PCR או הגברה איזותרמית.
- ערך תפעולי: משלב הכנת דגימות וזיהוי על גבי שבב, דבר המפחית את זמן העבודה הישירה ומאפשר פיתוח בדיקות ניתנות להרחבה עבור תהליכי עבודה בעתקת שפיכה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על שלמות הדגימות מרגע האיסוף ועד לגילוי, ובכך תומך בהמשכיות תרגומית במודלים פרה-קליניים של זיהום.
- ערך תפעולי: מאפשר זרימות עבודה סטנדרטיות עבור סוגי דגימות שונים (דם, שתן, צואה, מטושים) למען תרגום עקבי מהשלב הפרה-קליני לשלב הקליני.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות בביולוגיה מוקדמת ועד למוכנות של בדיקה (assay) בזיהוי מובילים (lead identification), ובמיוחד עבור דיאגנוסטיקה מבוססת חומצות גרעין המכוונת לסוכנים זיהומיים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות על ידי אספקת תשומות נקיות של חומצות גרעין עבור qPCR, רצף (sequencing), או זיהוי של חתימות ספציפיות לנתיב פתוגני המבוסס על CRISPR.
- סריקה: מספקת דגימות מוכנות לבדיקה בעלות טוהר וריכוז גבוהים, התומכים בסריקה אמינה של תרכובות או מעכבים בפיתוח נוגדי מיקרובים.
- אנליטיקה: מייצרת תנובות כמותיות של חומצות גרעין המאפשרות נורמליזציה בין תנאים שונים והשוואה סטטיסטית של יעילות הכנת הדגימה.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לעבודות פרה-קליניות על ידי שימור שלם של סממנים ביולוגיים (למשל, עומס ויראלי, גנים של עמידות) באמצעות ליזיס ואקסטרקציה משולבים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת מודול להכנת דגימות בעל אפשרות לשימוש חוזר, הניתן להתאמה למטרות מרובות (למשל, Influenza A, C. difficile) על פני תחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת שונות ביולוגית באמצעות התאושיה סטנדרטית של חומצות גרעיניות ממטריצות דגימה מגוונות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות ייצור תרמופלסטי ושילוב עמודות בהפעלה פוטו-כימית, המאפשרים ייצור בסדרות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטאות משופרת לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי יצירת קלטים אבחוניים מהימנים המפחיתים תוצאות שגואות שליליות בשלב המוקדם של תיקוף המטרה.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים אבחוניים מותאם לסיכון, באמצעות עיבוד דגימות עקבי ובעל תפוקה גבוהה לאורך תוכניות פרה-קליניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידיקה, כימיה של פני שטח ועקרונות של טיהור חומצות גרעיניות.
- תלוי בציוד להלחמה תרמופלסטית ובמערכות פולימריזציה המופעלות על ידי UV או אור לצורך ייצור עמודות בתוך השבב.
- מחייב סטנדרטיזציה של קצבי זרימה, תנאי ליזיס ונפחי אלוציה בין מפעילים ואתרים שונים להשגת ביצועים הדירים.
- כולל שיקולי התאמה לצמיגויות דגימה שונות ועומסי חלקיקים (למשל, צואה לעומת שתן) המשפיעים על יעילות הסינון והליזיס.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לאופטימיזציה של יעילות הליזיס עבור אורגניזמים שקשה לפרק (למשל, C. difficile) מבלי לפגוע בתאימות לאמפליפיקציה בשלבים הבאים.
