הפקה וניתוח של תמונות היסטולוגיה בעלות פרמטרים גבוהים באמצעות ציטומטריה של Histoflow
21 ביוני 2024
המתוארת כאן היא שיטה שניתן להשתמש בה כדי לצלם חמישה פרמטרים פלואורסצנטיים או יותר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent. מתואר צינור ניתוח לחילוץ תאים בודדים מתמונות אלה ולביצוע אנליזה של תא בודד באמצעות אסטרטגיות gating דמויות ציטומטריה של זרימה, אשר יכולות לזהות תת-קבוצות תאים במקטעי רקמות.
מטרת העל שלנו היא לחקור כיצד תאי מערכת החיסון ותאי גלייה במערכת העצבים המרכזית תורמים להתפתחות ולהתקדמות של הפרעות נוירולוגיות כגון טרשת נפוצה. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית היא טכניקה סטנדרטית ובשימוש נרחב על פני דיסציפלינות ביולוגיות והיא חיונית למדעי המוח ולמחקר האימונולוגיה. אחת הבעיות העיקריות המטרידות חוקרים היא שמיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי מוגבל בדרך כלל במספר הגשושיות שניתן לצלם בו זמנית בשל מגבלות המיקרוסקופים הקונבנציונליים.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה להרחבת מספר הגשושיות שמיקרוסקופים רבים יכולים לצלם בו זמנית, ומספקים צינור ניתוח לעיבוד תמונות צפופות מידע. היתרון של פרוטוקול זה הוא שניתן להתאים אותו למיקרוסקופים רבים הזמינים באופן נרחב וקל לביצוע, מה שיהפוך את ניתוח ההיסטולוגיה המרובב לזמין למספר רב יותר של מעבדות.
סקירה כללית
מחקר זה מתווה שיטה לדימות של פרמטרים פלואורסצנטיים מרובים באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, יחד עם תהליך ניתוח (pipeline) לנתונים ברמת התא הבודד. השיטה משפרת את יכולות הדימות המסורתיות ומאפשרת זיהוי של תתי-אוכלוסיות של תאים הקשורות לתפקודי תאי מערכת החיסון ותאי גליה בהפרעות נוירולוגיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית היא טכניקה חיונית במדעי העצבים ובאימונולוגיה.
- במיקרוסקופים קונבנציונליים קיימות מגבלות בנוגע למספר הגששים שניתן לצלם בו-זמנית.
- השיטה המוצעת שואפת להתגבר על מגבלות אלו ולהפוך את ניתוח ההיסטולוגיה הרב-ערוצית (multiplex) לנגיש יותר.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול המאפשר דימות ואנליזה של מספר תוויות פלואורסצנטיות.
- יצירת צינור ניתוח (analysis pipeline) התומך באנליזה של תאים בודדים בדומה לציטומטריית זרימה.
- מתן אפשרות להבנה טובה יותר של תפקידם של תאי מערכת החיסון ותאי גלייה בהפרעות נוירולוגיות.
שיטות שנמצאו בשימוש
- נעשה שימוש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית על חתכי רקמה צבועים.
- המחקר פירט גישה שלב-אחר-שלב להגדרת המיקרוסקופ ולביצוע פיצוי פלואורסצנציה.
- ניתוח התמונות כלל שימוש בכלי תוכנה להפרדה ולסימון של תאים בודדים.
- הפרוטוקול מאפשר התאמה למגוון מיקרוסקופים נפוצים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מבדילה ביעילות בין סוגי תאים שונים ברקמת לימפה צבועה.
- נעזרה למידת מכונה כדי להפריד בהצלחה תאים צפופים.
- הניתוח סיפק תובנות משמעותיות לגבי אוכלוסיות תאים בתוך חתכי רקמה.
מסקנות
- פרוטוקול זה משפר את היכולות של מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית מסורתית.
- מסלול העבודה שהוקם מייעל ניתוחים של תאים בודדים, ומאפשר גישה רחבה יותר להיסטולוגיה מולטיפלקסית.
- הממצאים עשויים לשפר את הבנתנו לגבי המנגנונים התאיים המעורבים בהפרעות נוירולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרות ניהוליות
דימות היסטולוגי בעל פרמטרים רבים באמצעות זרימה היסטולוגית (histoflow cytometry) פותר צוואר בקבוק קריטי באפיון תאי מערכת החיסון, על ידי מתן אפשרות לניתוח מרחבי מרובה (multiplexed) ברזולוציה של תא בודד. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים, במיוחד עבור רקמות מורכבות כמו מערכת העצבים המרכזית (CNS). גישה זו תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי שילוב של הקשר מרחבי עם ניתוח כמותי של תתי-אוכלוסיות של תאי חיסון, ובכך מספקת מידע לשלבי הגילוי המוקדמים ולמחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של השונות של תאי מערכת החיסון ותאי הגליה בתוך ארכיטקטורת רקמה שלמה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מיפוי תתי-אוכלוסיות של תאים והאינטראקציות המרחביות שלהם.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות אנליזה של סמנים מרובים בעלת תוכן גבוה.
- משפר את רמת הוודאות החזויה לבחירת מטרות בנתיבי עבודה של נוירואימונולוגיה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות רקמה מאושרות ועשירות במידע עבור תהליכי סריקה בהמשך השלב.
- מבצע סטנדרטיזציה של פלטים כמותיים של תאים בודדים באמצעות אסטרטגיות בידוד (gating) הדומות לאלו של ציטומטריה זרימה.
- מאפשר פרופיל תהליכים הדיר במגוון תנאים ניסיוניים עבור אוכלוסיות תאים.
- תומך בפיתוח בדיקות הניתנות להרחבה על ידי התאמה לפלטפורמות מיקרוסקופיות זמינות ונפוצות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את מיפוי תתי-האוכלוסיות של תאי מערכת החיסון למודלים של רקמת CNS הרלוונטית למחלה.
- שומרת על רציפות מרחבית ופנוטיפית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- מאפשרת קידום מותאם סיכונים באמצעות כימות שפע תאי סוגים מסוימים ואינטראקציות רקמתיות.
- מספקת תובנות לגבי סממנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים למחקר של הפרעות נוירולוגיות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימה
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר תרגומי על ידי שילוב של דימוי רב-פרמטרי עם אנליזה של תא בודד, ובכך היא תומכת בתהליכי עבודה החל מבדיקת השערות ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: מקדמת את בדיקת ההשערות על ידי מתן אפשרות לפרופיל תאי מרחבי ופנוטיפי מרובה (multiplexed).
- סריקה: מספקת נתוני תא בודד כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח מערך בדיקה (assay) חסון.
- אנליזה: מספקת פלט סטטיסטי וסינון (gating) בדומה לציטומטריה של זרימה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתונים של תתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון לסביבות רקמה הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה צינור (pipeline) דימוי ואנליזה בעל התאמה רחבה למערכות רקמות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של דימיון ואנליזה מרובי-ערוצים (multiplex) בין פלטפורמות וצוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודף מותאם-סיכון של תוכניות בתחומי ה-CNS והאימונולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ובפירוק ספקטראלי (spectral unmixing).
- נדרשת גישה למיקרוסקופים תואמים ולתוכנה מתקדמת לניתוח תמונות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, דימות וסינון (gating).
- ניתן להתאמה לסוגי רקמות שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מודלים ספציפיים.
- מורכבות ניתוח התמונות והבקיאות בתוכנה הן שיקולים מעשיים.
