אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להעריך כמותית את התגובות הפנוטיפיות הדינמיות של אוכלוסיות הטרו-תאיות לפרטובציות תוך הבחנה בין תת-אוכלוסיות. רוב האינטראקציות הפיזיולוגיות מתרחשות בנוכחות מספר סוגי תאים. שיטה זו יכולה לעזור לביולוגים של התאים להעריך כיצד תאים הטרוגניים מגיבים ללחצים סביבתיים זהים וכיצד לחצים שונים משפיעים זה על זה.

לטכניקה זו מספר יתרונות, היא מבחינה בין מספר סוגי תאים, היא מאפשרת ניתוח בו זמנית של תת-אוכלוסיות כולל שיעורי לידה ותמותה ודינמיקה מורפולוגית. בעוד שפרוטוקול זה יכול לשמש לחקר תהליכים ביולוגיים רבים, נדגים את זרימת העבודה באמצעות תאי גידול H3255 ותאי פיברובלסטים CCD19LU שטופלו בארלוטיניב, תרופה כימותרפית. כדי להתחיל, לאחר הכנת תרחיפי תאים בצינורות על פי פרוטוקול הטקסט, הפוך את הצינורות כדי לערבב את התאים בתמיסה כדי לתקן את הזריעה.

לאחר מכן פיפטה 10 מיקרוליטר מכל תרחיף תאים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה, והוסף 10 מיקרוליטר טריפאן כחול. הכניסו 10 מיקרוליטר מהתמיסה לשקופית ספירת תאים והכניסו את השקופית למונה תאים אוטומטי. חזור על ספירת התאים לפחות שלוש פעמים, או עד שהספירה המתקבלת תהיה עקבית.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, זרעו בסך הכל 1,500 תאים ב -100 מיקרוליטר RPMI בבארות של צלחת 96 בארות. צלחת כל מתלה תא בשלוש עותקים עם הגדרות צלחת זהות לכל נקודת זמן. דגרו על התאים למשך הלילה.

הוסף DMSO לאבקת ארלוטיניב כדי ליצור תמיסת מלאי ארלוטיניב של 10 מילי-מולאר. לאחר מכן, השתמש במדיום תרבית תאים כדי לדלל את התרופה פי שניים מהריכוז הסופי הגבוה ביותר של 10 מיקרומולר. לדלל את התרופה באופן סדרתי ארבע פעמים ביחס של 1:10, בסך הכל חמישה ריכוזי סם וללא פיקוח על תרופות.

פיפטה 100 מיקרוליטר של תמיסת תרופה לבארות המתאימות של צלחת 96 בארות התאים לריכוז תרופה סופי של 1x מדולל במדיום. לאחר מכן כדי לצבוע את התאים לסיווג מבוסס פלואורסצנטי, הכינו חמישה מיקרוגרם למיליליטר של כתם גרעיני וחמישה כתם מיקרו-מולרי של תאים מתים ב-PBS. לסיווג מבוסס מורפולוגיה, הכינו חמישה מיקרוגרם למיליליטר של כתם גרעיני, חמישה כתם תאים מתים מיקרומולרי וחמישה כתם תאים מיקרומולרי ב-PBS.

הוסף 20 מיקרוליטר תמיסת צבע לכל באר. לאחר מכן, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מוגנות מאור למשך 30 דקות. כדי להשיג תמונות, השתמש באתנול 70% כדי לנגב את תחתית הצלחת ולהניח את הצלחת בתא ההדמיה.

בכרטיסייה 'הגדרה' תחת 'בחירת ערוץ', לחצו על לחצן הפלוס להוספת הערוצים המתאימים לתמונה. תחת בחירת פריסה, הגדר ערימת z של תמונות בדיקה כל שני מיקרון, החל מאפס מיקרון וכלה ב-20 מיקרון, כדי לזהות את מישור המיקוד. לחץ על תצלום בזק מתחת לכל ערוץ כדי להעריך את העוצמות ולמטב את זמני החשיפה.

הזן ערכים גבוהים או נמוכים יותר תחת זמן כנדרש. גרעינים בתאים חייבים להיות ממוקדים על מנת להבטיח את דיוק הניתוח במורד הזרם. בסכמת הצלחת, הדגש את הבארות המתאימות.

לאחר מכן, בסכימת הבארות, הדגש את 25 השדות שיצולמו באופן דומה. תחת ניסוי הפעלה, זהה את הצלחת בשם הצלחת, ולאחר מכן, לחץ על כפתור ההתחלה כדי להפעיל את פרוטוקול רכישת התמונה עם מטרה של פי 10 ליצור תמונות TIFF בגווני אפור בערוצים שנבחרו. לאחר התקנת תוכנות הקוד הפתוח, ניתוח CellProfiler ו-CellProfiler, פתח את CellProfiler, לחץ על קובץ, ייבוא, צינור מהקובץ ובחר את הקובץ המתאים.

בחר את צינור הסיווג המבוסס על הקרינה כדי לסווג תאים כ-H3255 או CCD19LU על סמך עוצמת EGFP ולחשב תכונות מורפולוגיה. לחץ על הצג הגדרות פלט ולאחר מכן בחר את המיקום של קובצי התמונה לניתוח ואת היעד עבור הנתונים שחולצו. לפני הפעלת הניתוח, יש לבדוק את הפרוטוקול במצב בדיקה כדי לבדוק את ערכי הפרמטרים.

חשוב שפילוח גרעיני ותאי יהיה מדויק. פרוטוקול זה תוכנן לזהות תאים עם כתם גרעינים משתנה, להבטיח שערך הפיקסלים שבאמצעותו מתרחבים הגרעינים גדול מספיק כדי להסוות את הגרעינים עם כתם ה-DNA הגבוה ביותר, אך קטן מספיק כדי לא להסוות את הגרעינים שמסביב. כדי לסווג אוכלוסיות על סמך פלואורסצנטיות, ראשית, יש לשנות את קנה המידה של טווח עוצמת ה-GFP, לאחר מכן למדוד את עוצמת ה-GFP של כל גרעין מזוהה ולסווג אובייקטים על סמך סף מוגדר על ידי המשתמש.

לאחר מכן, לחץ על נתח תמונות כדי להתחיל בניתוח. לאחר השלמת הניתוח, עבור אל תיקיית הפלט המוגדרת כברירת מחדל כדי להציג את הנתונים המחושבים. לסיווג מבוסס מורפולוגיה, הפעל פרוטוקול מתאים בפרופיל התא כדי ליצור תכונות מורפולוגיה של תא שלם.

פתח את תוכנת Cell Profiler Analysis, בחר את קובץ מאפייני מסד הנתונים שנוצר ב- Cell Profiler ולחץ על פתח. לחץ על הכרטיסיה מסווג בפינה הימנית העליונה של המסך. כדי לקרוא לתמונות תאים אקראיות מהניסוי, לחץ על אחזור, התמונות יופיעו בחלון הלא מסווג.

סווג תאים באופן ידני כחיוביים או שליליים, המייצגים כאן את H3255 או CCD19LU על-ידי בחירה וגרירה של תאים לסל המתאים. לאחר סיווג של לפחות 50 תאים לכל תת-אוכלוסייה, לחץ על אימון מסווג ולאחר מכן לחץ על בדוק התקדמות. לבסוף, לחץ על ציון הכל כדי ליצור טבלה עם ספירת תאים עבור כל תת-אוכלוסייה.

בתרבית קרה הטרו-תאית של גידול H3255 ותאי פיברובלסטים CCD19LU, זוהו גרעינים וחולקו על סמך צביעת DNA. אוכלוסיות תאים סווגו על ידי פלואורסצנטיות מלאכותית או הכשרה באלגוריתם למידת מכונה לזיהוי סוגי תאים על סמך הבדלי מורפולוגיה. קיימת התאמה גבוהה בין המתודולוגיות המבוססות על הקרינה והמורפולוגיה.

שתי שיטות הסיווג נרמזו באופן עצמאי לאותן תמונות והסכימו ב-97.4% ו-92.5% על האוכלוסייה הלא מטופלת והמטופלת בהתאמה. כאן נחקרו שינויים במורפולוגיה של התא ובתגובה לטיפול בארלוטיניב. לאחר שלושה ימים של טיפול תרופתי, נצפתה ירידה בשטח הגרעינים ועלייה בשטח התא מתאי H3255.

ייתכן שהדבר נבע ממוות של תאים. כדי לבדוק אם לארלוטיניב הייתה השפעה ציטוטוקסית או ציטוסטטית על התאים, זוהו תאים מתים על סמך צביעת פרופידיום יודיד. נצפו השפעות ציטוטוקסיות וציטוסטטיות של ארלוטיניב על תאי H3255, עם עלייה במספר מקרי המוות וירידה במספר הלידות לאחר טיפול תרופתי.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים לא רצופות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הפרעות RA או CRISPR על מנת לענות על שאלות נוספות החוקרות גנומיקה פונקציונלית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לחקור את ההשפעה של תאי סטרומה על התקדמות הגידול בסוגי סרטן מרובים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור תגובות הטרו-תאיות לגירויים סביבתיים, במיוחד כיצד לנתח נתוני הדמיה מבוססי מיקרוסקופיה בצורה תפוקה גבוהה.