מיניסקופ מקליט אותות סידן בהיפוקמפוס של עכברים המנווטים בפלומת ריח
20 בספטמבר 2024
פרוטוקול זה חוקר את הקשר בין המוח להתנהגות בהיפוקמפוס CA1 בעכברים המנווטים בפלומת ריח. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב, כולל ניתוח לגישה להדמיה של ההיפוקמפוס, אימון התנהגותי, הקלטה ועיבוד של המוח במיניסקופ GCaMP6f, ונתונים התנהגותיים לפענוח מיקום העכבר מפעילות עצבית ROI.
מטרת המחקר שלי היא להבין כיצד המוח מעבד מידע מרחבי וחוש הריח. ואנחנו מנסים להבין את תפקידם של תאי העצב CA1 בהיפוקמפוס בניווט פלומת ריח. נכון לעכשיו, נעשה שימוש בטכנולוגיה של הקלטות חופשיות של נוירונים עם מיקרוסקופים זעירים לקידום המחקר בתחום.
מצאנו שאפשר לפענח את המסלול של העכבר המנווט את פלומת הריח על סמך תאי עצב ואותות סידן ב-CA1 הגב. טכניקה זו משלבת את היתרונות של טכנולוגיית מיני סקופ להקלטת אותות סידן GCaMP עם השורה המבוססת היטב של ניווט מרחבי בהיפוקמפוס CA1. כדי להבין טוב יותר כיצד מעגלים עצביים מניעים התנהגויות מורכבות, נחקור כיצד ניווט פלומת ריח נפגע במודל עכברי של מחלת אלצהיימר עם תפקוד לא תקין של היפוקמפוס CA1.
כדי להתחיל, בנה תא עם שני קירות אקריליים, ותקרה אקרילית, ורצפת פוליוויניל כלוריד מורחבת. שני הקירות הייחודיים האחרים מלפנים ומאחור חייבים להקל על זרימת האוויר. מקם ארבע קבוצות של מקורות ריח בשילוב עם פיות אספקת מים במרחק של 10 סנטימטרים זו מזו לאורך ציר ה-X.
התקינו מצלמה דיגיטלית מהירה מעל הזירה כדי לנטר את התנהגות בעלי החיים. השתמש בקוד פיתון מותאם אישית כדי לנהל את חומרת זירת הריח, והתוכנה משלבת את המצלמה ואת כל החומרה להגדרת הניסוי. הגדר את המצלמה הדיגיטלית לייצוא אות שעון בעת הקלטת מסגרות וידאו לסנכרון פוסט-הוק עם המיני סקופ.
מקם גלאי פוטוניזציה מיניאטורי עם תגובה מהירה, או PID, קרוב למקור הריח, ומקם גלאי פוטוניזציה זעיר אחר במרחק של 10 סנטימטרים. שנה את מתג הרווח בפאנל הקדמי של בקר ה-PID למצב X חמש. לאחר מכן החלף את מתג המשאבה בפאנל הקדמי של בקר ה-PID למצב גבוה.
בדוק את הדיודה פולטת האור או את נורית המצב LED בפאנל הקדמי של הבקר כדי לוודא שפלט החיישן מציג מתח אפס בהיעדר ריחות. העבר את הפוטנציומטר לקיזוז לאפס, את פלט המתח בהיעדר ריחות, והפעל את שסתום הריח בזירת הריח. מדוד את העיכוב בזיהוי פלומת הריח עם ה-PID בכל מיקום לאחר פתיחת השסתום.
כדי להתחיל, הגדר את החדר, המצלמה וגלאי הפוטוניזציה, או חיישני PID, לניסוי. לאימון העכבר, בקש ממנו לעבור לחלק האחורי של הזירה. לאחר שהעכבר מגיע לאחור, העבירו ידנית ריח ומים בנתיב אקראי, ותנו לעכבר לאתר את המקור ולשתות את המים.
לאחר שהעכבר לומד ליזום ניסויים, עבור לתוכנה אוטומטית להעברת ריחות. במשימת ניווט הריח הדו-נתיבי, בחר באופן אקראי אחת משתי יציאות ריח כדי לספק ריח. ותגמל את העכבר במים כשהוא מגיע לפיית המים הנכונה ראש תקן את העכבר והנח את המיני סקופ על גבי לוחית הבסיס באמצעות מיקרו מניפולטור.
הדק את בורג הסט כדי לאבטח את המיני סקופ. כוונן את עדשת ההרטבה החשמלית כדי למצוא את מישור המוקד האופטימלי, ולהבטיח את המספר הגדול ביותר של תאים עם עוצמת הקרינה הגבוהה ביותר. כדי להשיג טווח דינמי אופטימלי, השתמש ב-CA1 הגבי וקשר עכברי GCaMP 6-F אחד, והגדר את הספק המיני סקופ לסביבות 30% בקצב רכישה של 30 הרץ.
שחרר את העכבר בתוך זירת הריח כשהמיני סקופ מחובר ללוחית הבסיס. התחל רכישה עם לוח הממשק כדי להקליט את לוגיקת הטרנזיסטור-טרנזיסטור, או פלט TTL של המצלמה הדיגיטלית, ואת ההיקף המיני לסנכרון. התחל להקליט את המיני סקופ וסרטי התנהגות, והפעל את התוכנה האוטומטית למשימת ניווט הריח עם שתי פיות.
לאחר מכן סנכרן את המטא נתונים של זירת הריח, מסגרות מצלמה דיגיטליות מוקלטות ומסגרות מיני סקופ באמצעות קוד MATLAB synchronize_files_jove.m. באמצעות תיקון נורמה, בצע תיקון תנועה של מסגרות המיני סקופ המסונכרנות. זהה את אזורי העניין עם אותות אפס דלתא F על F המשתנים בזמן באמצעות תמצית.
השתמש באנסמבל התנהגות ובמצפה מסלול עצבי כדי לדמיין את ההתנהגות ואזורי העניין של כל ניסוי נפרד. תגובת ה-PID גדלה משמעותית עם שחרור פלומת הריח, מה שמעיד על עיתוי העברת הריח. מעברי סידן מרובים נצפו ב-CA1 הגבי של העכבר במהלך ניווט ריח, בקורלציה עם אירועי ריח ותגמול מים.
תגובות הסידן היו קשורות לשלבים שונים של משימת הניווט, כולל התחלת ניסוי, קבלת החלטות וחזרה. המסלול המרחבי של העכבר פוענח מאותות הסידן, וחשף את תפקידו של CA1 הגבי במיפוי ריח ומידע מרחבי.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הקשר בין המוח להתנהגות באזור ה-CA1 של ההיפוקמפוס בעכברים בעת ניווט בתוך נפיחה של ריח. באמצעות שילוב של אימון התנהגותי והקלטות miniscope GCaMP6f, המחקר שואף לפענח כיצד נוירונים בהיפוקמפוס מעבדים מידע ריחני ומרחבי, במיוחד בהקשר של מחלת האלצהיימר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- נוירוביולוגיה התנהגותית
- טכניקות דימות
רקע
- הבנה כיצד מעגלים עצביים מקלים על התנהגויות מורכבות.
- תפקידם של נוירונים באזור CA1 של ההיפוקמפוס בניווט מרחבי ובעיבוד ריח.
- השפעת מחלת האלצהיימר על התפקוד ההיפוקמפלי.
- שימוש בטכנולוגיית miniscope להקלטות נוירונליות in vivo.
מטרת המחקר
- לבחון כיצד נוירונים ב-CA1 של ההיפוקמפוס תורמים להתנהגויות ניווט לפי ריח.
- לבחון כיצד התנהגויות אלו משתנות במודל עכבר למחלת אלצהיימר.
- להשתמש בטכניקות דימות מתקדמות כדי לבצע קורלציה בין פעילות עצבית לבין התנהגות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקלטה באמצעות מיניסקופ (Miniscope) של נוירונים באזור CA1 הגבי של ההיפוקמפוס במהלך משימות ניווט לפי ריח.
- מודל עכבר למחלת אלצהיימר לצורך אימון ובדיקה התנהגותית.
- הניסוי כלל תא שתוכנן לניווט בתוך נפיחת ריח.
- תוכנה אוטומטית להגשת ריחות ולניטור התנהגותי.
- סנכרון של הקלטות וידאו והקלטות עצביות לצורך ניתוח נתונים.
תוצאים עיקריים
- פעילות עצבית המתואמת עם אירועים התנהגותיים במהלך ניווט באמצעות ריח.
- טרנזיינטים של סידן שנצפו ב-CA1 הגבי היו קשורים לשלבים שונים של משימת הניווט.
- יכולת לפענח את המסלול המרחבי של עכברים על בסיס אותות סידן ב-CA1.
- המחקר חשף תובנות חשובות לגבי המנגנונים העצביים העומדים בבסיס העיבוד הריחני והמרחבי.
מסקנות
- מחקר זה מעמיק את ההבנה של תפקודי ההיפוקמפוס בניווט ובעיבוד ריחות.
- התוצאות תורמות לתובנות על הפגיעה בתפקודים אלו במודלים של מחלת אלצהיימר.
- מדגיש את התועלת של טכנולוגיית ה-mini scope בחקר תפקודים נוירונליים הקשורים להתנהגות מורכבת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פענוח של פעילות עצבית בהיפוקמפוס במהלך ניווט מורכב המונחה על ידי ריחות מספק מודל תרגומי להבנת אינטגרציה מרחבית וחושית במחקר של מחלות ניווניות. תהליך עבודה זה מאפשר מיפוי כמותי של דינמיקת אנסמבלים עצביים אל מול פלטים התנהגותיים, ובכך תומך בביטחון חיזוי באימות מטרות לצורך גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). גישה זו מחזקת החלטות בשלבי פיתוח מוקדמים של פורטפוליו על ידי קישור תפקוד ברמת המעגל העצבי לפנוטיפים הרלוונטיים למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה של תפקוד מעגלים בהיפוקמפוס בהקשרים התנהגותיים הרלוונטיים למחלה.
- תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות מתאם בין פעילות של מאגף עצבי לבין ביצועי ניווט.
- מסייעת בתיקוף פונקציונלי של מטרות עבור מסלולים במערכת העצבים המרכזית (CNS) המעורבים בעיבוד מרחבי וריחוני.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספקת פלטפורמה מתוקפת של התנהגות והדמיה להערכה כמותית של פעילות עצבית.
- מבצעת סטנדרטיזציה של רכישת נתונים וסנכרון בין מודליות התנהגותיות ועצביות.
- מאפשרת מדידה הדירה של תנודות סידן כתוצרי בדיקה כמותיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר דפוסי פעילות עצבית עם פנוטיפים התנהגותיים הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- תומך ברציפות החל משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני במודלים של ניוון עצבי.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי קידום מבוסס התאמה לסיכון, בהסתמך על קריאות של מעגלים פונקציונליים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
סבב עבודה זה, המבוסס על מיני-מיקרוסקופ (miniscope), משלב שלבי גילוי מוקדמים ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים בקווי מחקר של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת תגובות של מעגלים עצביים לאתגרים התנהגותיים, ובכך תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים.
- סריקה: מספק פלטי דימות סידן כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- אנליטיקה: מספק סטים של נתונים התנהגותיים ועצביים מסונכרנים להשוואה סטטיסטית חסונה של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פעילות של אנסמבלים עצביים לבין ליקויי ניווט הרלוונטיים למחלה, ובכך מסייע בגיבוש אסטרטגיות לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תפקוד של מעגלים עצביים במגוון מודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) והפחתת סיכונים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולים התנהגותיים ופרוטוקולי דימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי קישור פעילות עצבית לתוצאות תפקודיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות ומודלים של CNS בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות in vivo, נוירוביולוגיה התנהגותית וסנכרון נתונים.
- דורש מיכשור ייעודי הכולל מיניסקופים, עדשות GRIN ומערכות רכישת וידאו מסונכרנות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים התנהגותיים ותהליכי עיבוד נתונים.
- התאמה בין מודלים של מחלה עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור מעגלים עצביים או התנהגויות ספציפיות.
- שלבי תיקון תנועה וזיהוי ROI הם קריטיים לקבלת פלטים כמותיים מהימנים.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:11
Setting up the Odor Arena and Photoionization Detector Sensors for Mouse Odor Plume Navigation Studies
3:04
Behavioral Training and Epifluorescence Recording of a Freely Moving Mouse in the Odor Arena for Monitoring CA1 Neuronal Activity to Decode Spatial Navigation
