כימות התנהגות הטיפוח של Drosophila melanogaster להערכת פנוטיפים של טיפוח יתר

המחקר שלנו מעריך התנהגויות טיפוח בדרוזופילה מלנוגסטר לאחר נוקדאון Atg8a בתיווך RNAi כדי להדגים ליקויים ב-GABARAP שנצפו בחולי תסמונת טורט. אנו שואפים להבין את תפקידו של aAtg8a בהתפתחות התנהגותית, ולספק תובנות לגבי הפונקציות הרגולטוריות של מקבילו האנושי בתהליכים נוירו-התנהגותיים. האתגרים הניסויים הנוכחיים בשיטת ההערות הידניות כוללים את התהליך האנליטי המורכב, כגון הערות וסקירת צילומים, ואת הסובייקטיביות הכרוכה בהערות ידניות.

שיטות אוטומטיות מתמודדות גם עם אתגרים, כולל הדרישה למומחיות משמעותית במדעי המחשב כדי ליישם ולבצע ביעילות. מצאנו כי הגן Atg8a ממלא תפקיד בהתפתחות ההתנהגות של זבובי פירות מעבר למה שנקבע בעבר. ליתר דיוק, מצאנו שהוא מווסת הן את הטיפוח והן את הלמידה, מה שמרמז על כך שאורתולוגים של Atg8a עשויים למלא תפקידים דומים באורגניזמים אחרים.

טכניקה זו מאפשרת כימות ישיר של תדירות הטיפוח וההפצה בדרוזופילה. זה שימושי במיוחד במעבדות שאינן מסוגלות להשתמש בשיטות אוטומטיות ומאפשר ניתוח מפורט יותר מאשר שיטות עקיפות מבוססות צבע. בסך הכל, המחקר שלנו מקדם את השימוש בדרוזופילה כאורגניזם מודל לחקר הפרעות נוירו-התפתחותיות המציגות התנהגות אובססיבית-קומפולסיבית כמו תסמונת טורט.

זה גם מוסיף לראיות ההולכות וגדלות לכך שחלבונים הקשורים לאוטופגיה ממלאים תפקיד בהתפתחות התנהגותית. כדי להתחיל, הניחו ארבע מנות שלוש בארות זו לצד זו על משטח לבן וכסו כל מנה בשקופית זכוכית. מקם מצלמה מעל הכלים.

ודא שאין בוהק במגלשות שעלול להגביל את הנראות של זבובים בצלחת והתאם את מיקום הצלחת או עמעם את האורות לפי הצורך כדי למנוע סנוור. כעת סמן את מיקום הכלים והמצלמה על הספסל בו מתבצעת ההקלטה. הניחו זבובים בני ארבעה עד תשעה ימים על גוש קרח מכוסה בפרפילם ומגבת נייר כדי להרדים אותם קלות.

לאחר ההרדמה, העבירו את הזבובים לתאי תצפית במהירות האפשרית באמצעות מברשת צבע. הניחו זבוב אחד בכל באר של צלחת שלוש הבארות, והבטיחו הפרעה מינימלית כדי להימנע מגירוי שינויי התנהגות הנגרמים על ידי לחץ. לאחר התאקלמות הזבובים 30 דקות לאחר ההרדמה, הקליטו את הזבובים באמצעות מצלמה, ואז פתחו את הטרמינל והקלידו cd PiSpy.

הקלד python3 PiSpy. py, והזן את אורך ההקלטה וקצב הפריימים הרצויים. בחר את הרזולוציה הרצויה ולחץ על לכידה מהירה.

כעת השתמש בפונקציית התצוגה המקדימה של המצלמה ב-Pi Spy כדי להבטיח שהזבובים ממוקדים ונראים מספיק. הקלט את הזבובים למשך 10 דקות בקצב פריימים מומלץ של 24 פריימים לשנייה ושמור את הקובץ. כדי לנתח את הסרטון, ייבא את הקובץ לתוכנת ELAN 6.8 להערות מפורטות וניתוח מעמיק של התנהגויות טיפוח.

בחר רמה, הוסף רמה חדשה, הקלד מיקום במנה בשם הרמה והוספה כדי להקצות כל שורה להוספת ביאורים לצילומים של אנשים באופן ידני. כדי להוסיף ביאורים להתנהגויות, לחץ פעמיים על הרמה שיש להוסיף לה ביאורים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני וגרור את הסמן לאורך הרמה שנבחרה למשך תקופה שבמהלכה מוצג סיבוב טיפוח יחיד. לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור ביאור חדש ולחץ פעמיים על פרק הזמן החדש שהודגש כדי להקליד את הקיצור של אופן הפעולה שנצפה באותה נקודת זמן.

לאחר שהסרטון מוסבר במלואו, קבל פירוט של כל התנהגות על ידי לחיצה על תצוגה, ואחריה סטטיסטיקת הערות. זהה טיפוח קדמי כטיפוח המבוצע באזור הקדמי של גוף הזבוב. זהה טיפוח אחורי כטיפוח המבוצע בקצה הקדמי-אחורי של גוף הזבוב.

התקפי הטיפוח עלו באופן משמעותי במוטציות Atg8a RNAi בהשוואה לקבוצות הביקורת. זמן הטיפוח היה גם גבוה משמעותית במוטציות Atg8a RNAi בהשוואה לביקורת. לא נצפו הבדלים משמעותיים בהתפלגות התנהגויות הטיפוח הקדמיות לעומת האחוריות.