מיצוי DNA מבוסס מטריצה לריצוף ממוקד של הדור הבא על דגימות ליחה מטוהרות

המחקר שלנו עוסק בהפחתת זמן האספקה של אבחון שחפת והתחלה לאחר מכן על ידי שילוב NGS לטיפול מותאם אישית בחולים. הפרוטוקול שלנו מייעל את TNGS לשימוש שגרתי על ידי התייחסות לאינטגרציה של זרימת עבודה, עלות וזמן אספקה, במטרה להפחית עיכובים באבחון ולשפר את התחלת הטיפול בזמן.

פרוטוקול זה מאפשר מיצוי DNA חסכוני, מהיר ואיכותי מספיק מדגימות קליניות תוך שעות בהשוואה לשיטות CTAB הקונבנציונליות, הנמשכות עד שלושה ימים.

התוצאות שלנו מעלות שאלות מפתח לגבי שילוב TNGS באבחון שגרתי ואופטימיזציה של שיטות מיצוי לדגימות שליליות ודלות כדי לשפר את הרגישות והתועלת הקלינית. אנו נחקור האם ניתן להשתמש בדגימות שאריות מאבחון שגרתי לריצוף במורד הזרם, כולל ריצוף גנום שלם ישיר של ליחה כדי לייעל ולהרחיב את המעקב הגנומי של שחפת.

[קריין] כדי להתחיל, השג משקע ליחה מושבת בחום. צנטריפוגה את הדגימה ב-16,800 גרם, או במהירות מלאה למשך 15 דקות. עם פיפטה של 20 עד 200 מיקרוליטר, שאפו בעדינות והשליכו את הסופרנטנט, כדי להבטיח שהכדור יישאר ללא הפרעה. נענע בעדינות את מתלה המטריצה לערבוב, ואז פיפטה 200 מיקרוליטר מהמטריצה המעורבת היטב כדי להשעות מחדש את הגלולה. העבירו את הנפח המלא לתוך צינור מכסה בורג של 1.5 מיליליטר המכיל שלושה חרוזי זכוכית מעוקרים מראש בקוטר שני מילימטרים. כעת, הניחו את הדגימות בבלוק חימום בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הומוגניזציה של הדגימות עם מערבולת למשך 10 שניות כדי לפזר את התאים, ולאחר מכן לדגור את הדגימות בבלוק חימום ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הומוגניזציה של הדגימות באמצעות הומוגנייזר במהירות גבוהה עם מחזור אחד של 60 שניות במהירות של 4.0 מטר לשנייה. לאחר מכן, צנטריפוגה את המתלה ב -12,000 גרם למשך חמש דקות. העבירו 130 מיקרוליטר של הסופרנטנט המכיל DNA לצינור טרי של 1.5 מיליליטר בעל קשירה נמוכה מבלי להפריע לגלולה. השלך את הצינור הראשון המכיל את המטריצה ופסולת התא. כדי לטהר את ה-DNA באמצעות חרוזים מגנטיים, תחילה מערבל את בקבוק מלאי החרוזים המגנטיים או הכין אליקוט ביסודיות כדי להשעות מחדש את החרוזים לפני השימוש, ולאחר מכן הוסף פי 1.2 מנפח החרוזים המגנטיים ל-DNA שחולץ, פיפט את התרחיף 10 פעמים כדי לערבב את הדגימות לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הנח את הדגימות על מתלה מגנטי של צינור 1.5 מיליליטר למשך שלוש דקות, או עד שהנוזל מתבהר, ואז שאב בזהירות והשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים. עם הצינורות על המגנט, הוסף 200 מיקרוליטר של 80% אתנול, וודא שהחרוזים יישארו ללא הפרעה. לאחר דגירה של 30 שניות, שאפו בזהירות והשליכו את האתנול מבלי להפריע לחרוזים. לאחר הכביסה השנייה, הסר את כל שאריות האתנול באמצעות פיפטה של 1 עד 10 מיקרוליטר. השאירו את הצינורות פתוחים לייבוש החרוזים באוויר למשך 10 דקות, או עד שהם בעלי מראה מט. לאחר שהחרוזים בעלי מראה מט, הסר את הצינורות מהמגנט והוסף 50 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ישירות על החרוזים בכל דגימה. לאחר מכן, מערבבים כל דגימה בודדת על ידי פיפטינג 10 פעמים. בדוק את הצינור לאיתור חרוזים שנתקעו בפנים. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, הנח את הצינורות בחזרה על המדף המגנטי למשך שלוש דקות, או עד שהנוזל צלול. עם הצינורות על המדף המגנטי, העבירו את הסופרנטנט המכיל DNA לצינור סטרילי בעל קשירה נמוכה המסומן בבירור. ריכוז ה-DNA היה גבוה יותר בדגימות משקעים של שני מיליליטר, בהשוואה ל-500 מיקרוליטר בכל דרגות המריחה. שונות גדולה יותר בתפוקת ה-DNA נצפתה בדגימות משקעים של 500 מיקרוליטר. עומק הכיסוי של קריאות הריצוף היה גבוה יותר בדגימות משקעים של שני מיליליטר בהשוואה ל-500 מיקרוליטר בכל דרגות המריחה. השונות הייתה גדולה יותר בשלוש דגימות בדרגת מריחה פלוס שחולצו ממשקעים של 500 מיקרוליטר. ציוני קבילות הרצף היו בדרך כלל גבוהים יותר בדגימות של שני מיליליטר בהשוואה ל-500 מיקרוליטר, עם שיעור גדול יותר של תוצאות מקובלות מאוד. לדגימות בדרגת מריחה שלוש פלוס היה השיעור הגבוה ביותר של תוצאות מקובלות, בהשוואה לדרגות מריחה אחת פלוס ושתי פלוס. בדגימות של 500 מיקרוליטר היו יותר מקרים שסווגו כבלתי קבילים או לא נקבעו.